去垢剂的性质和应用

Vicki Caligur

MilliporeSigma

什么是去垢剂?

去垢剂是两亲性分子,包含极性或带电亲水基团(头部)和在长亲脂性烃基基团(尾部)(图1)。由于可降低水的表面张力,它们也被称为表面活性剂。

阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)的结构

图 1.阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)的结构,显示出了疏水区域和亲水区域。

这些结构特性使得去垢剂可以在水性介质中聚集。在足够高的浓度下,每个分子的极性亲水区域朝向极性溶质(水),而疏水区域聚集在一起,形成一个具有疏水核心的热力学稳定的胶束。去垢剂胶束的疏水核心区域与蛋白质的疏水表面结合,形成可溶性的蛋白质-去垢剂复合物。图2是胶束的一个简单图例,用于演示朝向这一概念。实际的胶束结构是更复杂和动态的,并可以根据去垢剂的浓度和溶液的组成而变化。1

十二烷基硫酸钠胶束的简单图例

图 2.十二烷基硫酸钠胶束的简单图例。

生物去垢剂通常用于破坏细胞的双极脂质膜,从而释放和溶解膜结合蛋白。一些去垢剂可被用于溶解重组蛋白,而另一些则被用于蛋白质的稳定、结晶和变性。去垢剂可以在水/非水界面处排列,从而降低表面张力,增加混溶性并稳定乳状液。其他的去垢剂应用包括:

  • 提取DNA和RNA
  • 溶解标本用于诊断应用
  • 细胞裂解
  • 脂质体制备
  • 防止溶液中的试剂和被分析物沉淀
  • 防止免疫测定中的非特异性结合

去垢剂的物理特性

胶束开始形成时的浓度被称作临界胶束浓度(CMC)。CMC是单体的最大浓度,并且可以因此对形成胶束的自由能进行量度。CMC越低,胶束越稳定,并且分子并入胶束或脱离胶束的速度越慢。去垢剂疏水区域的结构会影响胶束的结构。离子型去垢剂疏水烃链的长度增加会导致胶束增大和CMC降低,同时构建胶束需要的分子也减少。

胶束中单体的平均数量被称作聚集数。CMC和聚集数的值很大程度上取决于以下因素:温度、pH、离子强度以及去垢剂的均一性和纯度。用来测定CMC和聚集数的分析方法的不同可能会造成报道数值的轻微差异。聚集数的值也会因浓度而变化,当浓度高于CMC时,单位胶束中的去垢剂分子数目会增加。

易于去除或交换是选择去垢剂时需考虑的一个重要因素。一些常见的去除去垢剂的方法包括:

  • 透析
  • 凝胶过滤色谱
  • 疏水吸附色谱
  • 蛋白沉淀

去垢剂相关的CMC值是疏水结合强度的重要参考。去垢剂的CMC值越高其结合越弱,相应的也越容易通过透析或置换方法去除。而CMC值较低的去垢剂则只需要较少的去垢剂就可以形成胶束并溶解蛋白质或脂质。

另一个用于评估后续去除去垢剂难易度的有用参数是胶束分子量,表示相对胶束大小。越小的胶束越容易去除,在基于蛋白质分子尺寸的蛋白质-去垢剂复合物分离时效果也更理想。胶束分子量可以用单体分子量乘上聚集数来计算。

浊点是指当浓度接近或高于CMC时,去垢剂溶液分离成两相的温度。胶束聚集,形成高去垢剂浓度的混浊相,而溶液达到平衡点时会耗尽去垢剂。得到的两相溶液可以被分离,提取出的蛋白质位于富含去垢剂的相中。因为高浊点温度会造成溶解蛋白质的变性,因此在蛋白质存在时推荐使用低浊点的去垢剂,例如TRITON® X-114 (浊点~23 °C)。去垢剂浓度和温度的变化以及添加盐或聚合物(例如葡聚糖和聚乙二醇)等因素都会影响浊点。需要注意的是富含去垢剂的相也取决于去垢剂的种类和盐浓度;在某些条件下,相可以是澄清的而不是混浊的,可以作为溶液的上相或下相。对于非离子型去垢剂,这一特点已被用于膜蛋白的相分离和提纯。2

去垢剂的种类和选择

选择去垢剂时,首先需要考虑的通常是亲水基团的组成:

根据分子结构,去垢剂可大体分为:3

  • 离子型
  • 两性离子型
  • 非离子型

离子型去垢剂

离子型去污剂含有阴离子或阳离子头部基团,并具有净电荷。它们的疏水尾巴要么是直链烃链(例如十二烷基硫酸钠(SDS)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)),要么是刚性甾体基团(例如胆汁酸盐)4。离子去污剂胶束的大小取决于 侧链的疏水引力和离子基团的斥力。因此,通过增加中和头部基团上电荷的抗衡离子浓度,可形成较大的胶束尺寸。胶束的大小也随着烷基链长度的增加而增加。离子去污剂在膜蛋白增溶方面非常有效,但难免或多或少造成变性5

胆汁酸盐是阴离子去垢剂,具有由刚性甾族基团(例如胆酸和脱氧胆酸的钠盐)组成的主链。由于为平面结构,这些分子具有极性和非极性的表面;因此,它们的CMC较高且其胶束较小,易于通过透析去除。6胆汁酸盐是相对温和的去垢剂,与同头部基团的线性链去垢剂相比,其失活性通常较小。7未偶联的胆汁酸盐单体pKa值约为5-6,在低pH值下溶解度有限。但是,在任何给定的pH值下,胆汁酸偶联都会降低pKa,产生更大比例的离子化分子。由于离子盐形式比质子化酸形式更易溶于水,因此在低pH值下,偶联可增加溶解度8

非离子型去垢剂

非离子型洗涤剂含有不带电荷的亲水性头基,由聚氧乙烯部分(如BRIJ®和TRITON™去垢剂)或糖苷基团(如辛基葡糖苷和十二烷基麦芽糖苷)组成。由于非离子型去污剂会破坏脂质-脂质和脂质-蛋白质的相互作用,但不会破坏蛋白质-蛋白质的相互作用,因此被认为是非变性。9 因此,它们广泛用于分离生物活性形式的膜蛋白。与离子型去垢剂不同,盐对非离子型洗涤剂的胶束尺寸影响极小。5

具有聚氧乙烯头基团的去垢剂可以包含烷基聚乙烯醚(CnH2n+1(OCH2CH2)xOH),或烷基链与醚基之间包含苯环。TRITON™X-100去垢剂属于后一类。需要注意的是,含有芳香环的去垢剂在紫外线区域吸收。它们可能会干扰分光光度法280 nm处的蛋白质监测。这些去垢剂可提供氢化形式,其中芳香环被还原以消除紫外线吸收。但是,在这种还原制剂中可能存在少量未反应的材料。在某些应用中,具有脂族疏水部分的市售聚氧乙烯去垢剂可以代替某些芳族聚氧乙烯。例如,在紫外线不可见光波长应用中,通常可采用TERGITOL™ 15-S-9、TERGITOL™ TMN-10、聚氧乙烯10月桂基醚和聚氧乙烯10十三烷基醚代替TRITON™X-100。这些去垢剂具有脂族疏水部分,因此不会明显吸收紫外线区间波长。

尽管聚氧乙烯比合成的非离子型去垢剂(如烷基糖苷)具有明显的成本优势,但由于两大原因,后者在许多应用中仍是首选去垢剂。首先,它们的组成和结构均一。其次,可利用它们轻松合成几种包含不同烃链和极性糖基组合的烷基糖苷变体。可利用附接到葡萄糖、麦芽糖或蔗糖头基上,带有各种烷基链的烷基糖苷的理化性质细微差异,选择性溶解膜蛋白。10

两性去垢剂

两性去垢剂同时具有离子型和非离子型去垢剂的特点。和非离子型去垢剂一样,两性去垢剂不具有净电荷,无导电性和电泳迁移性,且不与离子交换树脂结合。但和离子型去垢剂一样,它们可以有效地破坏蛋白质间的相互作用。与线性链两性离子去垢剂(例如十二烷基二甲基二胺氧化物)相比,固醇类两性去垢剂(例如CHAPS)的变性概率较小。7

非去垢剂磺基甜菜碱

非去垢剂磺基甜菜碱(NDSB)是两性离子化合物。和去垢剂磺基甜菜碱(SB)– 例如线性SB(例如SB 3-16、SB 3-10、3-12 后文 3-14)、11 CHAPS12和氨基磺基甜菜碱(例如N-烷基氨基丙基-N,N二甲基氨基烷基磺酸盐)13一样 – NDSB带有磺基甜菜碱亲水性头基。但与SBs相比,NDSB中的疏水基太短,即使浓度高达1 M时也无法形成胶束。因此,NDSB易于通过透析去除,且易于在色谱基质和聚丙烯酰胺凝胶中扩散,适用于电泳应用。

NDSB首先用于天然等电聚焦实验中,以在不增加电导率的情况下筛选静电相互作用。14从那时起,它们被广泛应用,包括蛋白质的增溶和结晶14,15,以及化学和生物变性蛋白质的复性和重折叠。16凭借短疏水基团和电荷屏蔽作用,NDSB可防止聚集并提高膜蛋白产量。此外,NDSB不会干扰涉及硝基苯基的显色底物的酶法测定,且不会抑制酶(例如β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶)的活性。14值得注意的是,NDSB-195、NDSB-211和NDSB- 221不吸收280 nm波长的光线;因此,它们与蛋白质纯化程序兼容,可在蛋白质纯化过程中通过测量该波长吸光度监测蛋白质浓度。17

去垢剂选择指南

如果裂解液或匀浆100,000 x g离心1小时后上清液中存在膜蛋白,则认为该膜蛋白已溶解。在大多数情况下,去垢剂溶解后,会在上清液中保留蛋白质的生物学活性。因此,适当的去垢剂会在上清液中产生大量生物活性蛋白。鉴于当今市面上的去垢剂种类众多,选择合适的去垢剂可能会很困难。下面概述了部分有助于选择合适的去垢剂的要点。

  • 查阅文献,尝试使用先前已用于分离和表征类似生化或酶学性质的蛋白质的去垢剂。
  • 考虑去垢剂在工作温度下的溶解度。例如,丙磺酸二甲基棕榈酰胺(SB3-16)在4°C下不溶于水,而TRITON™X-114去垢剂在室温下会发生相分离。
  • 考虑去垢剂去除方法。如果要进行透析,显然优选高CMC去垢剂。如果使用离子交换色谱,则非离子或两性离子去垢剂更佳。
  • 保留活性生物或酶活性可能需要试验几种去垢剂。除去垢剂种类外,去垢剂用量也会影响蛋白质活性。对于某些蛋白质,仅可在很窄的去垢剂浓度范围内保留其生物学活性。低于该范围,蛋白质不溶解;高于特定浓度,蛋白质灭活。
  • 考虑下游应用。由于TRITON™X-100去垢剂含有260-280 nm吸收波长的芳环,因此如果操作规范要求紫外线监测蛋白质浓度,则应避免使用这种去垢剂。同样,如果要等电聚焦分离蛋白质,则应避免使用离子型去垢剂。进行蛋白质凝胶过滤时,应考虑使用聚集数较小的去垢剂。
  • 考虑去垢剂纯度。应使用纯度尽可能高的去垢剂,因为目前确知某些去垢剂(例如TRITON™X-100)含有过氧化物污染物。
  • 对于存在DNase、RNase和蛋白酶等污染问题的任何研究,可使用多种分子生物学级去垢剂。
  • 与有毒去垢剂相比,优先选择无毒去垢剂。例如,洋地黄毒苷(洋地黄甙)需要特别小心处理。
  • 由于未知的原因,某些去垢剂通常可以更好地用于特定分离程序。例如,目前已发现正十二烷基-β-D-麦芽糖苷是用于分离细胞色素C氧化酶的首选去垢剂。因此,可能需要通过一些“试错”方法,确定分离生物活性膜蛋白的最佳条件。
  • 有时很难找到理想的去垢剂溶解和分析特定蛋白质。在这种情况下,通常可以用一种去垢剂溶解蛋白质,然后再用对实验影响最小的另一种去垢剂代替。
  • 在某些情况下,已观察到隔离缓冲液中含有磺基甜菜碱(NDSB)去垢剂可大幅提高可溶性膜蛋白产量。

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