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离心基础知识

Mark Frei

MilliporeSigma

天然引力和离心力

在一定时间内,地球引力足以分离许多类型的粒子。在工作台上放一个装有经过抗凝处理的全血的试管,最终内容物将分离成血浆、红细胞和白细胞几个部分。然而,对于大多数应用来说,时间长度要求使得无法用这种方式分离。

在实践中,需要用离心力来分离大多数粒子。此外,长时间存放也可能会使生物化合物发生降解,这意味着需要更快的分离技术。

离心分离是实验室应用最基本的方法之一,被大量临床和研究人员所使用。离心分离其实就是利用沉降机制分离颗粒。尽管离心沉降并不是一项新技术,但由于其可提供目标纯化颗粒,日渐成为前沿基因组和蛋白质组学研究至关重要的技术之一。

通过重力来分离悬浮粒子的速率主要取决于粒子的尺寸和密度。较高密度或较大尺寸的粒子通常以较快的速率行进,在某个点上,就会与密度和尺寸较小的粒子分离。包括细胞在内的粒子的沉降可以通过斯托克斯方程来解释,该方程描述了球体在重力场中的运动。1该方程用五个参数计算沉降速度(见图1)。

斯托克斯方程

图 1.斯托克斯方程。

粒子行为和分离

根据斯托克斯方程,可以解释粒子的五个重要行为:

  1. 粒子沉降速率与粒子大小成正比。
  2. 沉降速率与粒子和介质之间的密度差异成正比。
  3. 当粒子密度与介质密度相同时,沉降速率为零。
  4. 随着介质粘度的增加,沉降速率降低。
  5. 随着重力的增加,沉降速率增加。

相对离心力

大多数粒子都太小,以至于其重力不足以克服粒子的随机分子力,因而影响分离。离心是给分离应用赋予的名称,其涉及围绕轴旋转以产生离心力,这是增加重力场强度的一种方式。悬液中的粒子经受径向离心力,使它们远离旋转轴线。2

旋转转子产生的径向力相对于地球引力来表达,因此被称为相对离心力(RCF)或 “克力“。作用在粒子上的克力与旋转速度(定义为每分钟转数,rpm)成指数关系。

加倍转速会使离心力增加四倍。离心力也随着距旋转轴的距离增加而增加。这两个参数对于选择合适的离心机,具有重要意义。表1总结了可根据相对离心力分类的应用。3

表1离心机的类别及其应用。

* 可完成,但通常不用于此目的。

RCF取决于转速以及粒子与旋转中心的距离。当转速 (Q)以rpm为单位,距离 (r)以厘米为单位,则可以用图2中的公式计算RCF。

RCF 计算公式

图 2.相对离心力(RCF)的计算公式。

低速离心诺模图

还可用诺模图根据想要的RCF来查到所需的离心机转子的转速(参见图3)。这种快速估算对于低速离心应用非常有用。但是,对于超过10,000 rpm的速度,使用RCF计算更为准确。

用于估算离心转速rpm的诺模图

图 3.用于估算离心转速rpm的诺模图。

诺模图使用说明

  1. 测量从离心转子中心至试管架末端的半径(cm)。
  2. 获得应用所需的相对离心力。
  3. 用直线将半径值与相对离心力值(g)相连,该直线与最右列相交处的数即为转子的转速(rpm)。

密度梯度离心

密度梯度离心技术可根据粒子大小、形状和密度进行分离。此技术通常通过在离心管中随密度分层,形成密度梯度。当样品在密度梯度上分层并离心时,各种粒子以不同的速率通过梯度。粒子在梯度中呈现带状;密度越大、粒子越大,迁移的越远。

密度梯度介质

目前我们已经研究了许多不同的化合物密度梯度介质。1950年代开发了第一代密度梯度离心技术,以蔗糖溶液作为缓冲溶液纯化细胞器。蔗糖迅速成为分离均质哺乳动物组织的首选密度介质。后来,氯化铯梯度开始用于分离不同密度的DNA。Meselson和Stahl于1958年通过一个精巧的实验,证明了DNA复制的半保留性。胶态二氧化硅悬浮液最初由 DuPont 制造,并以LUDOX®的名称出售X®4

1977年,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)包被的稳定二氧化硅胶体(Percoll®)开始可用于分离细胞和亚细胞粒子。1968年,Boyum描述了使用多糖和不透射线造影剂混合物从循环血液和骨髓中分离单核细胞的方法。这也导致1970年代开发了第一种非离子碘化密度梯度介质甲甲泛葡胺。5现有大量商业碘化密度梯度介质可供选择。

参考文献

1.
Sharpe PT. 2012. Methods of Cell Separation. Elsevier Science.
2.
Graham J. 2001. Biological Centrifugation. 1. Garland Science.
3.
Rickwood D, Ford T, Steensgaard J. 1994. Centrifugation: Essential Data. Wiley.
4.
Rickwood D. 1984. Centrifugation: A Practical Approach. 2. Oxford University Press.
5.
Rickwood D. 1983. Iodinated Density Gradient Media, A Practical Approach. Oxford University Press.