木瓜

图 1.分离自木瓜(番木瓜)乳

物理性质和动力学

木瓜蛋白酶是肽酶C1家族的一种半胱氨酸蛋白酶。它由单一多肽链组成,含有三个二硫键和一个酶活性所必需的巯基。

分子量: 23,406 Da(氨基酸序列)16
活性最适pH:6.0-7.0
活性最适温度:65 °C22
pI:8.75 17; 9.55 18 光谱特性:
λmax:278 nm 19
消光系数:E1% = 25 19
消光系数: EmM = 57.6 (at 280 nm) 20

单位定义:在25 °C ,pH 6.2条件下,一单位每分钟水解1.0 µmole N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙酯。

木瓜蛋白酶

图 2.木瓜蛋白酶

特异性

木瓜蛋白酶可消化大部分蛋白底物,比胰蛋白酶范围更广。木瓜蛋白酶具有广泛的特异性,可断裂基础氨基酸,亮氨酸或甘氨酸的肽键。它还能水解脂类和酰胺类化合物。木瓜蛋白酶更倾向于P2位置有大的疏水侧链的氨基酸,它不接受P1'位置的缬氨酸。1

应用

  • 木瓜蛋白酶广泛应用于细胞分离操作,在某些组织中已被证实比其他蛋白酶效率更高且破坏性更小。例如,木瓜蛋白酶可用于分离有活性的,形态完整的出生后大鼠的皮质神经元。2我们的木瓜蛋白酶(货号No. P4762)可用于分离平滑肌细胞3,4,能够分离出大量的有活性的平滑肌细胞,并且不影响细胞对刺激剂的敏感性5
  • 木瓜蛋白酶的部分水解作用可用于酶和其它蛋白质的结构研究。6-8
  • 木瓜蛋白酶可应用于红细胞血清学,它通过对红细胞表面的修饰来加强或破坏许多红细胞抗原的反应性,可作为分类、抗体筛选、抗体鉴定的辅助手段。在血小板血清学中,木瓜蛋白酶也有应用。9
  • 木瓜蛋白酶也可用于氨基酸、肽链和其它分子的酶合成。10-13
  • Fab 和 F(ab')2抗体片段可用于不能出现Fc域的实验系统。在这种情况下,只用抗原结合片段(Fab)更为合适。木瓜蛋白酶可用于常规制备免疫球蛋白G的 Fab片段。免疫球蛋白M也可被木瓜蛋白酶消化,产生大量的同种Fab片段。15
  • 木瓜蛋白酶将抗体切割为两个Fab片段(其可变区能够特异性识别抗原),和一个Fc片段。14它的切割位置在重链之间二硫键的铰链区之上,重链和轻链中间二硫键位点之下,从而形成了两个分开的Fab片段单价体(各包含单一抗体结合位点),和一个完整的Fc片段。各个片段可用凝胶过滤、离子交换或者亲和层析法来纯化。抗体消化和抗体片段提纯方法可参见《Antibodies: A Laboratory Manual》(E. Harlow and D. Lane, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)。
  • 在淋巴结、脾脏等组织,或是外周血制剂中,含Fc受体的细胞(如巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等)可结合完整抗体的Fc域,导致不含目标抗原的区域也出现背景染色。Fab片段的应用确保了抗体仅结合抗原而非Fc受体。这些片段也可用于血浆存在情况下的细胞染色,因为它们不能结合可溶解细胞的补体。Fab片段的应用使得目标抗原定位更精准,例如在电子显微镜的组织染色中。
胃蛋白酶和木瓜蛋白酶切割

图 3.胃蛋白酶和木瓜蛋白酶切割

抑制剂
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底物
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溶解度和溶液稳定性

木瓜蛋白酶以10mg / ml溶于水中。使用之前,稀释于含5 mM L-半胱氨酸的缓冲液中。它的活化/稳定剂包括EDTA、半胱氨酸和二巯基丙醇。21

尽管木瓜蛋白酶溶液具有很好的温度稳定性,不过它的稳定性却依赖于pH。在酸性条件下,木瓜蛋白酶溶液并不稳定,例如在pH低于2.8时其活性大幅下降。在溶解状态下,木瓜蛋白酶的活性每天约丧失1-2%,可能是自我分解和/或氧化作用所致。

在分离过程中获得的木瓜蛋白酶常见的非活性形式,是蛋白质的活性位点巯基和游离半胱氨酸之间形成的混合二硫化物。23

木瓜蛋白酶溶液在几种变性剂中也保持稳定,例如经70%甲醇和8M尿素溶液再结晶之后依然保持完整活性。不过,经10%三氯乙酰或6M盐酸胍处理后木瓜蛋白酶的活性大幅下降。

产品
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参考文献

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