Fehérje tömegspektrometria
A fehérje tömegspektrometriát széles körben használják biológiai minták elemzésére biomarkerek felfedezése, proteomikai kutatások és klinikai alkalmazások céljából. A fehérjék nagyléptékű jellemzésére használt más technikákkal összehasonlítva a tömegspektrometria a proteomika elsődleges eszközévé vált, mivel komplex elemzésekre alkalmas.
A tömegspektrometriát a fehérjék kvantitatív azonosítására és jellemzésére használják szerkezetük, poszttranszlációs módosulásaik és kölcsönhatásaik alapján.
- A fehérjék azonosítása jellemzően a fehérjék kémiai vagy enzimes emésztését jelenti peptidekké, amelyeket aztán tömegspektrometriával elemeznek, és számítási módszerekkel vagy szekvenálással azonosítanak.
- A poszttranszlációs módosítások az aminosavmaradékok tömegének változásán keresztül azonosíthatók. A módosítások helyeit szekvenálással vagy számítási módszerekkel lehet feltérképezni.
- A glikánok elemzésére és profilalkotására enzimatikus vagy kémiai módszereket használnak a glikánrészek glikoproteinekből való felszabadítására, majd a felszabadult glikánok derivatizálására a tömegspektrométeres elemzéshez.
- A fehérje kölcsönhatásokat egy specifikus célfehérje affinitási együttes tisztításával határozzák meg a kölcsönhatásban lévő fehérjékkel, vagy globálisabban vizsgálják méretkizárásos vagy ioncserélő kromatográfiával a tömegspektrometriás elemzést megelőzően.
Kapcsolódó termékek
A kvantitatív proteomikához a fehérjéket vagy peptideket kémiai úton stabil izotópokkal lehet jelölni a tandem tömegjelölés (TMT) és az iTRAQ segítségével, vagy metabolikus úton, jelölt aminosavak beépítésével (SILAC). A nehéz és könnyű izotópok beépítésének összehasonlítása lehetővé teszi a relatív mennyiségi meghatározást a tömegspektrométer-csúcsok intenzitásának a fehérjék mennyiségével való korrelálásával. Az abszolút kvantitatív meghatározáshoz a mintákat izotóposan jelölt szintetikus peptid- vagy fehérje-standardokkal lehet spiccelni a kiválasztott reakciómonitorozás (SRM) elemzéshez
A fehérje-tömegspektrometriában a különböző fehérjék és peptidek tömegét a gázfázisú ionjaik m/z (tömeg-töltés) arányának mérésével határozzák meg. A tömegspektrométerek először a fehérjemolekulákat egy ionforrás segítségével gázfázisú ionokká alakítják. Ezután egy tömegelemző készülék az ionizált analiteket az m/z arány alapján választja szét. Ezután egy detektor rögzíti az egyes m/z-értékeknél lévő ionok számát. A peptidek vagy fehérjék ionizálására általában a MALDI és az elektrospray ionizációt (ESI) használják.
MALDI-TOF tömegspektrometria
A MALDI olyan ionizációs módszer, amely lézerenergiát elnyelő mátrixot használ a fehérjemolekulák minimális fragmentációjú ionok előállítására. A mintát először összekeverjük egy megfelelő mátrixanyaggal. Ezután egy impulzuslézer besugározza a mintát, ami mind a minta, mind a mátrixanyag ablációját és deszorpcióját kiváltja. Az analitmolekulákat ezután protonálással vagy deprotonálással ionizálják az ablált gázokban, mielőtt tömegspektrometriás elemzésre kerülne sor.
Elektrospray-ionizációs tömegspektrometria
Az elektrospray-ionizáció (ESI) ionokat állít elő elektrospray segítségével, amelyben a folyékony mintára nagy feszültséget alkalmaznak, hogy aeroszolt hozzanak létre, így a peptidek és fehérjék minimális fragmentációjával ionokat generálnak. Az elektronsugaras ionizációt általában a tömegspektrometria és a folyadékkromatográfia (LC-MS) összekapcsolásakor használják, mivel a folyadékkromatográfiás eluátum közvetlenül az elektronsugaras ionizátorba vezethető a tandem feldolgozáshoz.
Munkafolyamat
Emésztés és címkézés
A helyspecifikus proteázokat, mint például a tripszin, arra használják, hogy a fehérjéket kis fragmentumokra hasítsák, hogy lehetővé tegyék az azonosítást a kísérleti spektrumok és a fehérjeadatbázisokból származó elméleti spektrumok összevetésével vagy a futtatott standardokkal való összehasonlítással. A relatív mennyiségi meghatározáshoz a sejtkultúrákat metabolikusan meg lehet jelölni az aminosavak etetésével beépített stabil izotópok segítségével, vagy a mintákat kémiai módszerekkel stabil izotópokkal lehet jelölni. A minták izotópokkal jelölt szintetikus peptidekkel való feltöltése lehetővé teszi az abszolút kvantitást a szelektív reakciómonitorozás (SRM) segítségével.
Kalibrálás és standardizálás a fehérje tömegspektrometriában
A kalibrációs standardok kontrollként szolgálhatnak a mintaelemzéshez, és felhasználhatók a fehérjeazonosság, a kísérleti érzékenység, az emésztés hatékonyságának meghatározására, valamint a kromatográfiás elválasztás és a mennyiségi elemzés segítésére.
Kromatográfiás elválasztás
A kromatográfia lehetővé teszi a fehérjék és peptidek elválasztását az elemzéshez kezelhetőbb mintákba. Mivel több különböző peptidnek is lehet hasonló tömege, a HPLC-t általában arra használják, hogy megakadályozzák a nagyon hasonló vagy azonos tömegű peptidek egyidejű hozzáadását a tömegspektrométerhez, növelve ezzel a mérések teljes dinamikai tartományát.
Észlelés és elemzés
A fehérjéket és peptideket a kimutatás és elemzés előtt MALDI vagy ESI ionizálással ionizáljuk. A tömegelemző készülék az m/z értékek alapján különbözteti meg az ionokat. Az így kapott fragmentációs mintázatok felhasználhatók az azonosításhoz, és a minták viszonylagosan kvantitálhatók az izotópos jelöléssel megkülönböztetett mintákból származó csúcsintenzitás-arányok kiértékelésével, vagy abszolút kvantitálhatók a jelölt belső standardokkal végzett SRM-elemzéssel.
Látogasson el dokumentumkeresőnkbe adatlapok, tanúsítványok és műszaki dokumentációk kereséséhez.
Kapcsolódó cikkek
- Learn more about Mass Spectrometry or MS including what it is, what it is used for and how it works.
- Protein-AQUA™™ offers robust targeted proteomics for quantitative studies across diverse research areas.
- Protein AQUA™ technique quantifies protein expression levels and phosphorylated peptides for various research applications.
- Standardize research with Universal and Dynamic Proteomics Standards, complex and well-characterized reference standards for mass spectrometry.
- Rapid trypsin digest kit yields reliable results in less than 2 hours for mass spectrometry analysis.
- Mindent látni (19)
Kapcsolódó protokollok
- Refinement of protein dual-labeling protocol using EnPresso® B Defined Nitrogen-free showcased by Vernalis, Ltd. for drug discovery.
- SigmaMab Antibody Drug Conjugate Mimic, is a non-toxic drug mimic utilized as a standard for mass spectrometry and high performance liquid chromatography.
- solution, 2 μg/mL in acetonitrile, analytical standard
- Explore mass spectrometry analysis of glycans for glycomic & glycoproteomic neutral & acidic glycan analysis. See a general mass spec glycan analysis procedure.
- Biomarkers play an essential role in the drug discovery and development process.
- Mindent látni (11)
További cikkek és protokollok keresése
Hogyan tudunk segíteni
Kérdés esetén kérjük, küldjön ügyféltámogatási kérelmet
vagy beszéljen ügyfélszolgálatunkkal:
Emailt küldjön [email protected]
vagy hívja a +1 (800) 244-1173-as telefonszámot
További támogatás
- Chromatogram Search
Use the Chromatogram Search to identify unknown compounds in your sample.
- Számológépek és alkalmazások
Web Toolbox - tudományos kutatási eszközök és források az analitikai kémia, az élettudomány, a kémiai szintézis és az anyagtudomány számára.
- Customer Support Request
Ügyfélszolgálat, beleértve a megrendelésekkel, termékekkel, számlákkal és a weboldal technikai kérdéseivel kapcsolatos segítséget.
- FAQ
Explore our Frequently Asked Questions for answers to commonly asked questions about our products and services.
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?Ügyfeleink kényelme érdekében ezt az oldalt géppel fordítottuk le. Törekedtünk arra, hogy ez a fordítás pontos legyen. A gépi fordítás azonban nem tökéletes. Ha nem elégedett a gépi fordítással, kérjük, tekintse meg az angol nyelvű változatot.