Fehérjemeghatározás bicinkoninsav (BCA) módszerrel
Termékek
Response not successful: Received status code 500
cél
Megadni egy standard eljárást az oldatok teljes fehérjekoncentrációjának mennyiségi meghatározására a BCA-módszerrel.
KÖZLTSÉGVIZSGÁLAT
Ez a protokoll minden olyan szabályozott termékre vonatkozik, amelynél a fehérjeelemzést a BCA-módszerrel kell elvégezni.
Megbeszélés
A fehérjék a lúgos Cu (II)-t koncentrációfüggő módon Cu (I)-vé redukálják. A bicinkoninsav a Cu (I)-re igen specifikus kromagén reagens, amely 562 nm-en abszorbancia maximummal rendelkező komplexet képez. E tulajdonsága miatt az 562 nm-en mért abszorbancia egyenesen arányos a fehérje koncentrációjával. Fehérje standardként szarvasmarha szérumalbumin szolgál.
MEGHATÁROZÁSOK
N/A
FELELŐSSÉGEK
N/A
MÓDSZER
ELJÁRÁS
/h2>Reagens
- BicinchoninicAcid oldat, termékszáma. B9643.
- Réz(II)-szulfát-pentahidrát 4%-os oldat, terméksz. C2284.
- Protein standard oldat, 1.0 mg/ml szarvasmarha szérumalbumin (BSA), termékszám: P0914.
- Vizsgálati minták
MEGJEGYZÉS: Más BSA is használható standardként. Ha azonban 1 mg/ml-re kell hígítani, a fehérje koncentrációját a 280 nm-en mért abszorbanciával kell megerősíteni, E1%280 = 6,67 használatával. A mintáknak 0,2 - 10 mg/ml fehérje között kell lenniük, hogy a vizsgálat lineáris tartományában maradjanak. Vízzel való hígításra lehet szükség ahhoz, hogy a tartományba essen.
Műszerek
- Spektrofotométer, Uvikon 943 vagy azzal egyenértékű.
- Pipetta/csúcsok
- Vizsgálati csövek
- Vizsgálati cső állvány
- Eldobható küvetták, termékszáma: Sz. C5416, vagy azzal egyenértékű.
- Inkubátorok, Imperial III, vagy azzal egyenértékű.
Védelmi óvintézkedések
A kémiai veszélyek és a megfelelő kezelési óvintézkedések tekintetében olvassa el az anyagbiztonsági adatlapokat (MSDS).
Módszer
1. Készítse el a fehérje meghatározó reagensét I ml Réz(II)szulfát-pentahidrát 4%-os oldat (C2284) 49 ml Bicinkoninsav oldat (B9643) 49 ml-hez.
2. Kvantitatív módon adja a jelzett mennyiségű vizet és fehérje standardot a jelzett csövekbe.
| cső | mL víz | mL fehérje standard |
|---|---|---|
| 1 | 0.5 | 0 |
| 2 | 0.3 | 0.2 |
| 3 | 0.2 | 0.3 |
| 4 | 0.1 | 0.4 |
| 5 | 0.0 | 0.5 |
3. Készítse elő a reakciócsöveket az alábbiak szerint: A mintákat két példányban kell elkészíteni.
| Tubus | mL fehérje standard | mL minta vagy kontroll | mg/ml fehérje | mL fehérje meghatározó reagens |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 1 | - | 0 | 2.0 |
| 2 | 0.1 | - | 0.4 | 2.0 |
| 3 | 0.1 | - | 0.6 | 2.0 |
| 4 | 0.1 | - | 0.8 | 2.0 |
| 5 | 0.1 | - | 1.0 | 2.0 |
| 6 | - | 0.1 | ? | 2.0 |
| 7 | - | 0.1 | ? | 2.0 |
4. A megfelelő keveredés biztosítása érdekében minden egyes csövet vortexeljen.
5. Inkubáljuk a csöveket 37 °C-on 30 percig.
6. Az abszorbancia mérése előtt hagyjuk a csöveket szobahőmérsékletre hűlni.
7. Ürítse ki a spektrofotométert vízzel szemben. Mérjük meg a standardok (1-6. csövek) abszorbanciáját 562 nm-en.
8. A standardok ismert fehérjekoncentrációját használjuk a standardgörbe elkészítéséhez. Ha az adatpontok jelentős eltérést mutatnak a standardgörbe vonalától, konzultáljon a tanszéki felügyelettel. A vonal meredekségének körülbelül 1,0-nak kell lennie.
9. Olvassuk le a minták abszorbanciáját 562 nm-en. A standardgörbe segítségével számítsa ki a fehérjekoncentrációt mg/ml-ben.
10. A végső fehérjekoncentrációhoz szorozzuk meg a hígítási tényezővel, amely szükséges volt ahhoz, hogy a koncentráció a vizsgálat lineáris tartományába kerüljön. A jelentéshez átlagolja a minta eredményeit.
11. Töltse ki a megfelelő munkalapot.
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?Ügyfeleink kényelme érdekében ezt az oldalt géppel fordítottuk le. Törekedtünk arra, hogy ez a fordítás pontos legyen. A gépi fordítás azonban nem tökéletes. Ha nem elégedett a gépi fordítással, kérjük, tekintse meg az angol nyelvű változatot.