Western Blotting protokoll (Immunoblotting protokoll)

A Western Blotting a fehérjéknek a nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélekről PVDF- vagy nitrocellulóz-membrán lapokra történő elektroforetikus átvitelére utal, amelyet a fehérjék fluoreszcens vagy kemilumineszcens detektálással rendelkező antitestek segítségével történő immunodetektálása követ. 

Western Blotting munkafolyamat lépései

1. Minta előkészítés: Sejtlízis és Protein extrakció
2. SDS-PAGE gélelektroforézis
3. Membrán transzfer
   a) Tank transzfer
   b) Félszáraz transzfer
4. Immunodetektálás
   a) Tank transzfer
   b) Félszáraz transzfer
5. Immunodetektálás
   a) Hagyományos immunodetektálás
   b) 30 perces immunodetektálási protokoll a SNAP i.d. használatával.^® rendszer
   
6. Hibaelhárítási útmutató

Membránátvitel (tartályos átvitel) Protokoll

Anyagok

• Blotting papír
• Transzfer membrán (például, Immobilon^® PVDF membránok)
• Transzferpuffer
• Metanol, etanol vagy izopropanol
• Tartályos transzferrendszer (például, SB10 omniPAGE mini elektroblotting rendszer)
• /li>
• Tápegység
  

Beállítás

1. Készítsen elegendő transzferpuffert a transzfertartály feltöltéséhez, valamint további 200 ml-t a gél és a membrán egyensúlyba hozásához és a szűrőpapír nedvesítéséhez.
   
2. Vegye ki a gélt a kazettából; vágja le az egymásra rakódó gélt és a mélyedéseket.
   
3. Merítse a gélt transzferpufferbe 10-30 percre.
   
4. Áztassa a szűrőpapírokat transzferpufferben legalább 30 másodpercig .
   
5. Készítse elő a membránt:
   
   
        a. PVDF-membrán használata esetén nedvesítse a membránt metanolban 15 másodpercig. A membránnak egyenletesen
             átlátszatlanná és félig átlátszóvá kell válnia.
        b. Óvatosan helyezze a membránt Milli-Q^® vízbe, és áztassa 2 percig.
        c. Óvatosan helyezze a membránt transzferpufferbe, és hagyja legalább 5 percig egyensúlyban állni.

Transfer Stack Assembly

1. Nyissa ki a kazettatartót.
   
   
   Fontos : Az egyenletes transzfer biztosítása érdekében távolítsa el a rétegek közötti légbuborékokat egy Blot Roller vagy egy pipetta vagy egy keverőpálca óvatos gördítésével a halom minden egyes rétegének felületén. Ne gyakoroljon túlzott nyomást, hogy elkerülje a membrán és a gél sérülését.
   
   
   
2. Tegyen egy habszivacs (szálas) párnát a kazetta egyik oldalára.
   
3. Tegyen egy lap szűrőpapírt a párna tetejére.
   
4. Tegye a gélt a szűrőpapír tetejére.
   
5. Helyezze a membránt a gél tetejére.
   
6. Helyezzen egy második lap szűrőpapírt a köteg tetejére.
   
7. Helyezze a második habpárnát a szűrőpapír tetejére.
   
8. Zárja be a kazettatartót.

A fehérjetranszfer (tartályos transzfer)

1. Tegye a kazettatartót a transzfer tartályba úgy, hogy a kazettatartó gél oldala a katód (-), a membrán oldala pedig az anód (+) felé nézzen.
   
2. Adjon a tartályba annyi puffert, hogy a kazettatartót ellepje.
   
3. A fekete katódvezetéket (-) dugja be a katódcsatlakozóba, a piros anódvezetéket (+) pedig az átviteli egység anódcsatlakozójába.
   
4. Az anódvezetéket és a katódvezetéket csatlakoztassa a megfelelő tápkimenetekhez.
   
5. Ha van, állítsa be a hűtőegységet a tartályátadó egységen a gyártó utasításai szerint.
   
6. Kapcsolja be a rendszert 1-2 órára 6-8 V/cm elektródák közötti távolságon. Kövesse a tartály gyártójának útmutatásait, az optimalizálás részleteiért.
   
7. A transzfer befejezése után vegye ki a kazettatartót a tartályból.
   
8. Az kampófogóval óvatosan szerelje szét az átviteli köteget.
    

Tippek a sikeres Western Blotting transzferhez

• Imindkét típusú transzferrendszerben (tartályos és félszáraz) fokozott óvatossággal kell eljárni, hogy a szűrőpapír, a gél vagy a membrán közé ne kerüljenek légbuborékok bárhol. 
• A fehérjéket állandó áram mellett kell átvinni. Ha állandó feszültségen történik az átvitel, ellenőrizze az áramot, hogy az ne haladja meg a 0,4 ampert. Kezdje 100 V-ról, és csökkentse a feszültséget, ha az áram túl magas
  
• A vastagabb gélek vagy nagyobb fehérjék hosszabb transzferidőt vagy nagyobb térerősséget igényelhetnek. A tényleges transzferfeltételeket minden egyes rendszerre optimalizálni kell.
• Az Immobilon® transzfer membránok mindkét oldala egyformán jól működik. Az egyik oldal megjelenése (fényes vagy matt) nincs hatással a membrán transzfer- és detektálási hatékonyságára.
• A kis peptideket tartalmazó minták esetében a gél transzferpufferben történő egyensúlyozását 10 percnél rövidebb időre kell korlátozni.
• A maximális visszatartás érdekében használja az Immobilon® PSQ -t, ha az érdeklődésre számot tartó fehérje 20 kDa vagy annál kisebb.
• Fluoreszcens detektálási módszerekhez használjon Immobilon®-FL transzfermembránt.
• A gélek egyenként vagy több gél egy kötegben is átvihető.

Félszáraz membránátviteli protokoll

Anyagok

• Blotting papír
• Transzfer membrán (például, Immobilon^® PVDF membránok)
• Anódpuffer I: 0.3 M Tris, pH 10,4, 10% (v/v) metanol.
• Anódpuffer II: 25 mM Tris, pH 10,4, 10% (v/v) metanol.
• Katódpuffer: 25 mM Tris, 40 mM 6-amino-n-kapronsav (glicin helyettesíthető), 10% (v/v) metanol, pH 9,4.
• Félszáraz blotter  (pl. Termékszám. B2529)
• Tápegység

Beállítás

1. Készítsen elő 200 ml-t mindegyik anódpufferből és 400 ml katódpufferből.
   
2. Vegye ki a gélt a kazettából; vágja le az egymásra rakódó gélt.
   
3. Áztassa a gélt 200 mL katódpufferben 15 percre.
   
4. Áztasson két darab szűrőpapírt legalább 30 másodpercre az I. anódpufferben.
   
5. Áztasson egy darab szűrőpapírt legalább 30 másodpercre a II. anódpufferben.
   
6. Áztasson három darab szűrőpapírt katódpufferben legalább 30 másodpercig.
   
7. Készítse elő a membránt:
        a. Nedvesítse a membránt metanolban 15 másodpercig. A membránnak egyenletesen átlátszatlanból félig átlátszóvá kell válnia.
        b. Óvatosan helyezze a membránt Milli-Q^® vízbe, és áztassa 2 percig.
         c. A membránt a vízbe helyezze. Óvatosan helyezze a membránt a II. anódpufferbe, és hagyja legalább 5 percig egyensúlyban állni.

Egyszeri átvitelhez:

1. Tegye az anódelektródlemezt egy vízszintes padlapra.
   
2. Tegyen két darab I. anódpufferbe áztatott szűrőpapírt a lemez közepére.
   
3. Tegye az első két lap tetejére a II. anódpufferben átitatott szűrőpapírt.
   
4. Tegye a membránt a szűrőpapírok tetejére.
   
5. Tegye a gélt a membrán tetejére.
   
6. Tegye a három darab katódpufferrel átitatott szűrőpapírt a membrán tetejére.
   
7. Tegye a katódelektródlemezt a köteg tetejére.

A többszörös átvitelhez:

1. Tegye az anódelektródlemezt egy vízszintes padlapra.
   
2. Tegyen két darab I. anódpufferrel átitatott szűrőpapírt a lemez közepére.
   
3. Tegye az első két lap tetejére a II. anódpufferrel átitatott szűrőpapírt.
   
4. Tegye a membránt a szűrőpapírok tetejére.
   
5. Tegye a gélt a membrán tetejére.
   Az utolsó gélhez menjen a 10. lépéshez.
   
6. Tegye a gél tetejére a katódpufferben átitatott szűrőpapírt.
   
7. Tegyen egy darab dialízismembránt a szűrőpapír tetejére.
   
8. Tegyen egy darab II. anódpufferrel átitatott szűrőpapírt a dialízismembrán tetejére.
   
9. Ismételje meg a 4-8. lépést, amíg az összes gélt (az egységhez tartozó maximumig) be nem építi a kötegbe.
   
10. Helyezzen három darab katódpufferrel átitatott szűrőpapírt az utolsó gél tetejére.
    
11. Helyezze a katódelektródlemezt a köteg tetejére.
    
    FONTOS: Ne ütögesse a katódlemez fedelét a futtatás során, mivel ez megzavarhatja a transzfer stack igazítását, és pontatlan eredményeket okozhat.

Módszer a fehérjetranszferhez (félszáraz)

1. A fekete katódvezetéket (-) helyezze be a katódlemez csatlakozóba.
   
2. A piros anódvezetéket (+) helyezze be az anódlemez csatlakozóba.
   
3. Csatlakoztassa az anódvezetéket és a katódvezetéket a tápegység megfelelő kimenetéhez.
   
4. Kapcsolja be a tápegységet.
   
5. Állítsa be az áramot, és hagyja futni a következő táblázatban megadott ideig:

1. táblázat.A félszáraz fehérjeátvitel ajánlott időpontjai

Az aktuális sűrűség	Időhatár
0.8 mA/cm2*	1-2 óra
1.2 mA/cm2	1 óra
2.5 mA/cm2	30-45 perc
4.0 mA/cm2	10-30 perc

*A felületet (cm²) az anódlemezre helyezett köteg lábnyomának méreteiből kell kiszámítani. Ez az érték független a kötegben lévő gélek számától.

Tradicionális immundetektálás

Az anyagok

• Primer és másodlagos antitestek
• Orbitális rázógép* (termékszám.Z768499)
• Vályúk 2-3 mm mélyek, valamivel nagyobbak, mint a blot mérete
• Detektáló szubsztrátok (peroxidáz- vagy foszfatáz-antitest konjugátumokkal való használathoz)
  - Kemilumineszcens szubsztrátok
  - Kromogén szubsztrátok

*Shaker és vályúk csak a hagyományos immundetektáláshoz szükségesek; a gyors, vákuumvezérelt immundetektáláshoz a
SNAP i.d. segítségével.^® rendszerhez lásd a SNAP i.d.^® immunodetektálási protokoll.

Antibody inkubációk

1. Tegye a blotot a blokkoló oldatba, és inkubálja kevergetés mellett 1 órán át.
   
2. Tegye a blotot az elsődleges ellenanyag oldatába, például Monoklonális anti-béta-aktin ellenanyag és inkubálja kevergetés mellett 1 órán át. Az oldatnak szabadon kell mozognia a membrán felületén.
   
3. Tegye a blotot PBS-be, és mossa 10 percig. Ismételje meg kétszer friss pufferrel.
   
4. Tegye a blotot a szekunder antitest oldat és inkubáljuk kevergetés mellett 1 órán át RT vagy 37 °C-on.
   
5. Tegye a blotot PBS-be, és mossa 10 percig. Ismételje meg kétszer friss pufferrel.
   
6. Folytassa kromogén, kemilumineszcens vagy fluoreszcens detektálással. Tekintse meg a kapcsolódó forrásokat is a fehérjék kimutatásához:
   A fehérjék kromogén és kemilumineszcens kimutatása
   Immunodetektálás BCIP/NBT szubsztrát használatával

Kémilumineszcens detektálás

Kövesse a gyártó utasításait.

1. Készítse el a szubsztrátot a gyártó utasításai szerint.
   
2. Tegye a blotot egy tartályba, és adjon hozzá szubsztrátot, hogy teljesen befedje a membránt.
   Inkubálja 1 percig.
   
3. Csöpögtesse le a felesleges szubsztrátot.
   
4. Helyezze a foltot egy tiszta üveglapra, és csomagolja be műanyag fóliába.
   Megjegyzés: Egy méretre vágott lapvédő vagy fagyasztózacskó is használható.
   
5. Óvatosan simítsa ki az esetleges légbuborékokat.
   
6. Sötét szobában helyezze a becsomagolt membránt egy filmkazettába.
   
7. Tegyen rá egy lap autoradiográfiás filmet, és zárja le a kazettát.
   
8. Exponálja a filmet. Többszörös, 15 másodperctől 30 percig tartó expozíciókat kell végezni az optimális expozíciós idő meghatározásához; az 1-5 perc az általános.

Fluoreszcens detektálás

Szükséges felszerelés

• A fehérjéket Immobilon^®-FL transzfer membránra blottoljuk és antitestekkel szondázzuk.
  
• Mylar^® fólia.
  
• Fluoreszcens képalkotó berendezés.

Az alábbiakban a fluoreszcens immunodetektálás általános protokollját mutatjuk be. Az optimális eredmények érdekében olvassa el a gyártó által a reagensekhez mellékelt protokollt.

Megjegyzés : Kemifluoreszcens reagensek használata esetén kövesse a reagens gyártójának utasításait.

1. Tegye a foltot hígított fluoreszcens festékkel jelölt másodlagos ellenanyag oldatba, és inkubálja 1 órán át enyhe keverés mellett.
   
2. Mossa a blotot 3-5 alkalommal, egyenként 5 percig mosópufferrel.
   
3. Tegye a blotot egy darab tiszta szűrőpapírra száradni.
   
4. Ha fóliát használ, használjon Mylar^®-t. Ne használjon Saran™ fóliát, mert az átengedi a fényt és elnyomja a fluoreszcenciát.
   
5. A blotot megfelelő fluoreszcencia szkennerrel képezze le.

.

2. táblázat.Western Blotting hibaelhárítási útmutató

Probléma	Megoldás	Megoldás
MegoldásNincs jel vagy gyenge jel vagy nem specifikus sávok	Szubsztrát vagy konjugátum gyenge vagy már nem aktív a kor vagy a nem megfelelő tárolás miatt	Vizsgálja meg a konjugátum és a szubsztrát aktivitását. Például adjon enzimkonjugátumot a szubsztrátoldathoz. Meg kell változtatnia a színét.
	Ha kemilumineszcens detektálást használ, a filmfejlesztő oldat lejárt	Új filmfejlesztő oldatot használjon.
	Nem megfelelő szubsztrát az alkalmazáshoz	Győződjön meg arról, hogy a kiválasztott szubsztrát megfelelő az enzimkonjugátumhoz.
	Nem megfelelően előkészített szubsztrát	Kövesse a szubsztráthoz mellékelt utasításokat. Győződjön meg róla, hogy szükség esetén friss H2O2 -t adunk hozzá.
	A primer vagy a szekunder ellenanyag helytelen hígítása<	./td>	Nézze meg a szakirodalomban vagy az adatlapon a használt antitestek ajánlott hígításait. Próbáljon ki többféle hígítást.A több nem mindig jobb, különösen az olyan érzékeny detektáló rendszerek esetében, mint a kemilumineszcencia. A legtöbb antitestünket olyan kolorimetrikus szubsztrátokkal teszteljük, amelyek nem olyan érzékenyek. Emiatt előfordulhat, hogy az antitestet 5-10-szeresére kell hígítani, ha kemilumineszcens detektálást használunk. Használja Szekunder antitest útmutató a másodlagos antitestek kiválasztására vonatkozó tippekért.
	Nem megfelelő elsődleges antitest az alkalmazáshoz		Győződjön meg arról, hogy az antitest bizonyítottan működik immunoblottingban. Nem minden antitest működik minden alkalmazásban. Előfordulhat, hogy az elsődleges antitest nem képes reagálni a vizsgált faj érdeklődésre számot tartó fehérjéjével. Ellenőrizze az irodalmat/adatlapot és a fehérje szekvenciainformációkat.
	Az érdeklődésre számot tartó fehérje nincs jelen vagy csak kis mennyiségben van jelen	Ha a pozitív kontroll működött, ellenőrizze a betöltött fehérje mennyiségét. Ha szükséges, próbálja meg immunprecipitációval vagy tisztítással feldúsítani a betöltött mintában a kívánt fehérje mennyiségét. Használja betöltési kontroll antitestek egyikét a megfelelő fehérjeátvitel biztosításához. A kívánt fehérje legjobb forrását az irodalomban találja meg. Lásd alább a "Rossz fehérjetranszfer" című részt.
		.Az alkalmazáshoz nem megfelelő másodlagos antitest	A másodlagos antitest esetleg nem képes kötődni az elsődleges antitesthez. Tesztelje ezt az elsődleges antitest egy kis darab membránra történő foltozásával. Amikor a folt megszárad, blokkolja, majd hígított másodlagos ellenanyaggal szondázza, mossa le és fejlessze ki szubsztráttal. Foltnak kell megjelennie, ha a másodlagos kötődött az elsődlegeshez.
	Inkubálási idő nem megfelelő	Inkubáljon legalább egy órát az elsődleges ellenanyaggal.
	Enzimgátló jelenléte	A nátrium-azid gátolja a peroxidáz reakciókat.
	Túlmosás	Lerövidíti a mosási időt, a mosópufferekből elhagyja a mosószereket.
	Gyenge fehérjetranszfer	Ellenőrizze a fehérjék átvitelét a membránra a membrán festésével Ponceau S (Termékszám. P7170) a blokkolás előtt.Győződjön meg arról, hogy a membrán egyenletesen nedvesedik a transzfer előtt. Tesztelje az átviteli időket. A kis fehérjék (< 10,000) esetleg átjutottak a membránon keresztül (próbáljon meg egy második membránt az első mögé illeszteni). A nagyobb fehérjék hosszabb transzferidőt igényelhetnek. Ellenőrizze a transzferpuffert - a magas metanol-koncentráció megakadályozhatja a fehérje gélről történő átvitelét. A transzferpufferben lévő 0,005-0,01% SDS növelheti a fehérje gélről történő átvitelét, de zavarhatja a fehérjék membránhoz való kötődését is. Ha a fehérje pI értéke >9,0, próbálja meg a CAPS, pH 9-et használni transzferpufferként. Használja a terhelési kontroll antitestek egyikét a megfelelő fehérjetranszfer biztosításához.
	A reagensek a nem megfelelő tárolás és kezelés miatt veszíthetnek aktivitásukból		A tárolási utasításokért olvassa el a termék adatlapját. Kerülje a túlzott fagyasztást/felolvasztást. Fluorofór-konjugált antitestek esetén győződjön meg arról, hogy az antitestet nem érte fény.
magas háttér vagy nem specifikus sávok	Elégtelen blokkolás	Kipróbáljon különböző blokkolási stratégiákat: Hosszabb blokkolási idő, magasabb % blokkoló, más blokkoló, blokkoló fehérje beépítése az antitest hígításokba, vagy próbáljon ki egy új adagot ugyanabból a blokkolóból.
	Az elsődleges antitest lehet, hogy nem elég specifikus	Kipróbáljon monoklonális vagy affinitással tisztított poliklonális antitestet.
	A primer ellenanyag magas koncentrációja	Nézze meg a szakirodalomban vagy az adatlapon a primer ajánlott hígítását. A rendszer optimalizálása érdekében próbálja ki a különböző hígításokat.
	Szekunder ellenanyag magas koncentrációja	Tesztelje ezt egy extra mintasáv lefuttatásával és az elsődleges antitest inkubáció kihagyásával az eljárásból. Ha ez a "csak másodlagos"ellenőrzés nem specifikus festődést eredményez, próbálja meg a másodlagos antitest további hígításait, vagy próbáljon ki egy másik másodlagos antitestet.
	A másodlagos antitest keresztreakcióba lép a mintában lévő más fehérjékkel<	A másodlagos antitest keresztreakcióba lép a mintában lévő más fehérjékkel./td>	Hígítsa a másodlagos ellenanyagot a mintával azonos fajból származó 1-5% normál szérumot tartalmazó pufferben. Használja a Secondary Antibody Guide a másodlagos antitestek kiválasztására vonatkozó tippeket.
	A többszörös sávok az érdeklődésre számot tartó fehérje proteolitikus fragmentumai lehetnek	Győződjön meg arról, hogy a minta előkészítésének első lépésétől kezdve proteáz inhibitorok vannak jelen. Tárolja és kezelje a mintakészítményeket úgy, hogy csökkentse a proteolízis esélyét. Ha lehetséges, próbálkozzon friss mintákkal.
	A szükségesnél hosszabb inkubációs idők	Rövidítse le az inkubációs időket.
	Túlinkubálás a kolorimetrikus szubsztrátoldattal	Levonja a festési időt. Tegye ki a membránt a szubsztrátnak, amíg pozitív jelet nem lát. Állítsa le a reakciót a membrán kimosásával, mielőtt a háttérszíneződés kialakulna.
	Nem megfelelő mosás	Növelje a mosások számát vagy szigorát.
	Szennyező enzimek jelenléte a mintában<	Vizsgálja meg a mintát csak szubsztráttal, hogy ellenőrizze a fehérjemintában lévő szennyező enzimaktivitást.
Fekete foltok	A blokkoló reagens összecsomósodott, és az antitestek kötődnek hozzá	Szűrje a blokkoló reagenst.
	Szennyező enzimek vannak jelen a mintában vagy szennyezik a blokkoló puffert	Szűrje a blokkoló puffert.
A sávok nem párhuzamosak	A gél nem polimerizálódott párhuzamosan	Tekintse át a gélkészítési eljárást.

Kapcsolódó anyagok

Sajnáljuk, váratlan hiba lépett fel

Response not successful: Received status code 500