Screening di genomica funzionale

I progressi nell'editing genico, nel silenziamento genico, nella modulazione genica, nel sequenziamento di nuova generazione (NGS) e nelle tecnologie di screening fenotipico consentono di effettuare gli screening di genomica funzionale in modo efficiente in un'ampia varietà di sistemi modello.

• Interferenza a RNA (RNAi): esistono diversi tipi di reagenti RNAi che vengono utilizzati per il silenziamento genico, inclusi i lunghi dsRNA (double-stranded RNA o RNA a doppio filamento), i siRNA (small interfering RNA o piccoli RNA interferenti) sintetici e gli shRNA (short hairpin RNA, o brevi RNA a forcina). Questi reagenti per RNAi vengono introdotti nelle cellule mediante trasfezione diretta (siRNA e dsRNA), trasfezione di un DNA contenente un promotore codificante per uno shRNA o mediante metodi di trasduzione virale utilizzando costrutti lentivirali in cui sono state clonate cassette shRNA. I dsRNA e i siRNA possono essere utilizzati in screening ad alta processività con formato array mentre gli shRNA possono essere introdotti nelle popolazioni cellulari per analisi ad alta processività sia in formato array che in pool, il formato in pool utilizza il sequenziamento di nuova generazione (NGS).
• Sistemi CRISPR-Cas: i sistemi CRISPR (brevi ripetizioni palindrome raggruppate e intervallate regolarmente) possono essere utilizzati per manipolare i genomi, i trascrittomi e gli epigenomi delle cellule di mammifero. Nell'editing genetico mediato da CRISPR-Cas9, la nucleasi Cas9 viene indirizzata ad uno specifico locus utilizzando un RNA guida. A seconda della variante di Cas9 impiegata, il sistema CRISPR può essere utilizzato per silenziare a livello genetico la produzione di un trascritto introducendo mutazioni frameshift, inibire la trascrizione, reclutare fattori di trascrizione per attivare l'espressione, indurre mutazioni puntiformi mirate o modificare marcatori epigenetici. Analogamente alla RNAi, il sistema CRISPR può essere introdotto direttamente come complesso RNP in screening formato array o come DNA plasmidico o mediante lentivirus per applicazioni di screening in formato sia pool che array. I pool, le librerie e gli array CRISPR facilitano uno screening dei geni eccezionalmente versatile e ad alta processività per l'analisi funzionale. E’ inoltre possibile effettuare uno screening con modulazione dell'espressione genica usando un sistema CRISPR privo di attività nucleasica che utilizza una dCas9 enzimaticamente inattiva combinata con effettori trascrizionali che attivano (CRISPRa) o inibiscono (CRISPRi) la trascrizione.