Applicazioni della reazione a catena della polimerasi (PCR)
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica fondamentale in biologia molecolare e costituisce un metodo in vitro rapido ed efficiente per amplificare con enzimi sequenze specifiche di DNA o RNA di provenienze diverse. Una PCR standard prevede un DNA bersaglio, una serie di primer oligonucleotidici sintetici complementari alle sequenze fiancheggianti la sequenza bersaglio del DNA, una DNA polimerasi termostabile (di solito Taq polimerasi) e nucleotidi. Utilizzando i termociclatori, ogni ciclo di amplificazione prevede tre passaggi: la denaturazione del DNA a doppio filamento (dsDNA) in DNA a singolo filamento, l’ibridazione dei primer con la sequenza bersaglio del DNA e l’estensione, in cui la DNA polimerasi estende il DNA a partire dai primer creando un nuovo dsDNA composto da un filamento vecchio ed uno nuovo. I filamenti sintetizzati in un ciclo servono da stampo per quello seguente col risultato che in appena 20 cicli la quantità di DNA aumenta di un milione di volte.
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RT-PCR (PCR a trascrittasi inversa)
La RT-PCR, o PCR a trascrittasi inversa, è una variante della PCR standard che comporta l’amplificazione di specifici mRNA a partire da quantità limitate di campione. Evita il noioso passaggio di purificazione dell’mRNA richiesto nelle tecniche di clonaggio convenzionali. Nella RT-PCR, in aggiunta ai reagenti della PCR standard si utilizzano la trascrittasi inversa e un campione di RNA. La miscela di reazione viene scaldata a 37 ˚C per consentire alla trascrittasi inversa di produrre una copia di cDNA complementare all’RNA campione. Questo cDNA si appaia in seguito con uno dei primer e porta alla sintesi del primo filamento. Da qui si prosegue con una PCR standard che porta alla produzione di dsDNA. La RT-PCR è spesso associata alla PCR in tempo reale (qPCR), che ha lo scopo di quantificare il livello di trascritti presenti in cellule e tessuti.
PCR Hot Start
La PCR Hot Start (con partenza a caldo) è una tecnica in cui l’attività della hot start Taq polimerasi, o l’incorporazione di dNTP modificati, vengono inibite durante la fase di preparazione della reazione, finché non avviene l’attivazione per esposizione al calore. Sono disponibili vari metodi per inibire l’attività della hot start polimerasi, incluse modificazioni chimiche o metodi basati sull’uso di anticorpi o aptameri.
PCR endpoint per un'amplificazione lunga e accurata del bersaglio
La PCR endpoint è spesso impiegata per rilevare la presenza di DNA bersaglio e la relativa abbondanza al completamento della reazione. La lunghezza limitata delle sequenze che è possibile ottenere mediante una PCR standard, circa 5 kb, è ovviata in parte incorporando fattori addizionali dotati di attività “proofreading”. Questa PCR lunga e accurata (LA) prevede l’uso di una seconda polimerasi termostabile con attività esonucleasica 3′→5′ in grado di riparare eventuali errori nell’incorporazione terminale dei nucleotidi col risultato di aumentare in modo significativo la fedeltà e la possibilità di amplificare dei DNA bersaglio di lunghezza fino a 40 kb.
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