qPCR
La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) si avvale di molecole reporter fluorescenti per consentire la quantificazione dei prodotti amplificati. Come nella PCR convenzionale si amplificano stampi di DNA, cDNA o RNA, ma ad ogni ciclo si misura la fluorescenza per la quantificazione relativa o assoluta.
Questa tecnica è utile in numerose aree della ricerca come l’analisi di espressione genica, la genotipizzazione, l’analisi di microRNA, l’analisi di variazioni genetiche e l’analisi di proteine.
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Come analizzare i dati della qPCR
Si misura e quantifica la fluorescenza delle molecole reporter che tipicamente sono coloranti (es. SYBR®green, bromuro di etidio) che si intercalano fra le basi di DNA a doppio filamento, o sonde disegnate per legare una determinata sequenza di DNA (es. fari molecolari, sonde TaqMan®).
Quantificazione relativa dei dati della qPCR
Per quantificare i dati della qPCR, si può ricorrere fondamentalmente a due metodi. La quantificazione relativa, il metodo più comune, utilizza il valore di ΔΔCt da cui si ricava il rapporto tra l'espressione, o l'abbondanza, del gene bersaglio nel campione rispetto a un gene di controllo, normalizzando i risultati in base all'espressione di un gene di riferimento. Poiché i valori dell'efficienza di amplificazione E del gene bersaglio e del gene di riferimento sono diversi, questo metodo deve tenere conto delle differenze dei valori di E. Questo metodo è impiegato più di frequente nelle analisi dell'espressione genica.
Quantificazione assoluta dei dati della qPCR
Il secondo metodo, la quantificazione assoluta, è utilizzata più comune nei lavori di microbiologia ambientale e ricorre a una curva standard (SC). Si avvale di diluizioni seriali di una molecola stampo a concentrazione nota, N0, per creare una curva standard applicando la regressione lineare ai valori di CT (ciclo soglia) in funzione di log(N0). La curva ottenuta viene poi usata per calcolare le concentrazioni dello stampo nel campione. Il metodo si basa sull’assunzione che l'efficienza di amplificazione del campione sia uguale a quella dello standard.
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