Elettroforesi su gel

Per condurre l’elettroforesi delle proteine su gel si può ricorrere a diverse metodiche, ciascuna delle quali fornisce informazioni diverse sulle proteine di interesse.

SDS-PAGE

L’SDS-PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecilsolfato) consente la separazione delle proteine​in base al loro peso molecolare. In questa metodica, al tampone di corsa si aggiunge il detergente SDS che conferisce una carica netta negativa alle proteine, mascherando la loro carica intrinseca. Inoltre, la presenza di SDS e reagenti denaturanti, fa sì che le proteine perdano la loro struttura nativa e siano presenti come catena polipeptidica lineare. Di conseguenza, la velocità con cui le proteine ​legate all’SDS migrano attraverso il gel dipende principalmente dalla loro dimensione, il che consente una stima del loro peso molecolare mediante il confronto con gli standard proteici.

PAGE nativa

Nell'elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native, le proteine sono separate in condizioni che consentono di preservarne la conformazione nativa (struttura terziaria), le interazioni tra subunità (struttura quaternaria e interazioni proteina-proteina) e l'attività biologica. In questa metodica, le proteine​vengono preparate e separate in condizioni non riducenti e non denaturanti. La mobilità delle proteine​ è qui determinata da una complessa combinazione di fattori; infatti, ogni proteina può migrare verso l'uno o l’altro degli elettrodi a seconda della sua carica, con una velocità di migrazione che dipende da parametri come la forma o la costituzione di interazioni. Per questi motivi, la PAGE nativa non è adatta per la determinazione del peso molecolare. Questa tecnica viene invece solitamente utilizzata quando si desidera la purificazione della proteina in forma attiva o la rivelazione da parte di un anticorpo che ne riconosce solo la forma nativa.

Focalizzazione isoelettrica (IEF)

La focalizzazione isoelettrica si avvale di un campo elettrico e di un gradiente di pH per separare le proteine​in base al loro punto isoelettrico (pI). Quando le proteine si muovono attraverso il gradiente di pH, la loro carica netta cambia. Se soggetta a un campo elettrico, una proteina migra in corrispondenza del pH al quale la sua carica netta è pari a zero (punto isoelettrico della proteina). Durante il processo di separazione, le proteine nel campione si accumulano (focus) in posizioni specifiche e prevedibili del gel. La focalizzazione isoelettrica viene utilizzata nell'identificazione di proteine da campioni complessi (ad esempio, lisati di cellule e tessuti, plasma), nell’analisi delle modifiche post-traduzionali e nella separazione di campioni per analisi di spettrometria di massa.

2D PAGE

L'elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilammide consente la risoluzione delle proteine in base sia al punto isoelettrico specifico (pI) che alla massa. La separazione in base al pI avviene tramite focalizzazione isoelettrica (IEF), quella in base alla massa per SDS-PAGE. La 2D PAGE fornisce la massima risoluzione per l'analisi delle proteine​ ed è comunemente usata nella ricerca proteomica per risolvere centinaia e persino migliaia di proteine su un singolo gel.