Analisi di ormoni in tracce nell’acqua di rete mediante LC-MS/MS
Nell’acqua di rete di diversi laboratori è stata rilevata la presenza di tre ormoni con metodi di LC-MS/MS. Successivamente alla purificazione di quest’acqua con sistemi Milli-Q®, gli ormoni non venivano più rilevati nell’acqua ultrapura prodotta, che poteva quindi essere utilizzata per analisi LC-MS/MS di ormoni.
Il ruolo dell’acqua ultrapura nelle analisi LC-MS/MS
L’HPLC accoppiata alla spettrometria di massa (MS) è utilizzata per analisi in tracce di composti organici nell’intento di risolvere problematiche concernenti la salute e la sicurezza. Poiché questi metodi presentano limiti di rivelazione estremamente bassi, durante il processo sperimentale è essenziale evitare, o almeno minimizzare, qualunque contaminazione. Componenti del cromatografo e dello spettrometro di massa1, gestione e manipolazione dei campioni2, ma anche reagenti e solventi utilizzati nelle analisi possono contribuire tutti quanti alla contaminazione e ai problemi che ne conseguono.
L’acqua riveste un ruolo importante nell’HPLC perché è ampiamente utilizzata in tutte le fasi del processo. È essenziale che gli analiti rilevati vengano dai campioni e non dall’acqua impiegata nelle diverse fasi dell’esperimento (come la preparazione dei campioni, degli standard, dei bianchi e degli eluenti oppure il risciacquo/ flussaggio dei sistemi per HPLC e MS).
Analisi di ormoni in tracce
Gli ormoni sono esempi di contaminanti emergenti (CEC) rilevati in tracce nelle acque ambientali e potabili di tutto il mondo.2,3 I CEC sono potenzialmente in grado di esercitare effetti ecotossicologici anche in concentrazioni estremamente ridotte.3
Si sono analizzati tre campioni di acqua di rete provenienti da Francia, Spagna e Cina. Nell’acqua di rete del laboratorio francese e di quello spagnolo si è rilevata la presenza di estradiolo e androsterone, mentre nel campione d’acqua proveniente dal laboratorio cinese è stato individuato il corticosterone. La Tabella 1 riassume i risultati delle analisi LC-MS/MS e la Figura 1 mostra i cromatogrammi dell’estradiolo acquisiti in modalità di monitoraggio a reazione multipla (MRM).
L’acqua ultrapura prodotta in ciascuno di questi laboratori è stata analizzata per la presenza dei suddetti tre ormoni utilizzando lo stesso metodo seguito per le analisi dell’acqua di rete. In tutti e tre i laboratori, nell’acqua ultrapura non si sono rilevati ormoni (Tabella 1).
| Ormone | Concentrazione (ng/L) | |
|---|---|---|
| Acqua di rete | Dopo la purificazione | |
| Estradiolo (Francia) | 265,40 | NR |
| Estradiolo (Spagna) | 297,92 | NR |
| Androsterone (Francia) | 515,33 | NR |
| Androsterone (Spagna) | 1635 | NR |
| Corticosterone (Cina) | 14,91 | NR |
Figura 1.Cromatogrammi MRM (ESI+) dell’estradiolo nell’acqua di rete e nell’acqua ultrapura dopo la purificazione con sistemi Milli-Q®. Si tratta di dati una tantum e riferiti a località singole; non sono pertanto rappresentativi dell’acqua nei diversi paesi di origine dei campioni.
Il grado di contaminazione organica dell’acqua è importante nelle analisi LC-MS/MS in tracce. Un’indicazione generale della contaminazione organica si ottiene con la determinazione del carbonio ossidabile totale (TOC). Per le analisi LC-MS/MS, si raccomandano livelli di TOC inferiori a 5 ppb, raggiungibili con i sistemi per la produzione di acqua ultrapura Milli-Q®.
Condizioni sperimentali per l’analisi di ormoni nell’acqua
Sistemi di purificazione Lab Water
Nel laboratorio cinese e in quello spagnolo si è utilizzato un sistema per il pretrattamento dell’acqua Milli-Q®, comprendente osmosi inversa intelligente, elettrodeionizzazione Elix® e lampada UV battericida, simile al sistema Milli-Q® IX. Dopo il pretrattamento, per produrre acqua ultrapura ci si è avvalsi di una soluzione Milli-Q® per la purificazione finale, simile al sistema Milli-Q® IQ 7000.
Nel laboratorio francese, per erogare l’acqua ultrapura si è utilizzata una soluzione Milli-Q® integrata capace di produrre acqua pura e ultrapura, simile al sistema Milli-Q® IQ 7003.
Strumentazione
Le analisi LC-MS sono state condotte su un cromatografo HPLC Agilent® 1290 Infinity accoppiato a uno spettrometro Agilent® 6420 a triplo quadrupolo (ESI+, MRM). Per separare gli ormoni mediante eluizione in gradiente si è utilizzata una colonna Hibar® HR 50-2.1 con fase stazionaria Purospher® STAR RP-18 endcapped (2 µm).
Campioni e standard
Per la quantificazione si è utilizzato il metodo dell’aggiunta dello standard (standard: androstenedione, androsterone, corticosterone, cortisone, estradiolo, estrone, progesterone, OH-progesterone, testosterone). Si sono raccolti campioni di acqua di rete e di acqua ultrapura prodotta dai sistemi di purificazione Milli-Q® del volume di 1 L; prima delle analisi LC-MS/MS, essi sono stati arricchiti mediante estrazione in fase solida (SPE). I campioni sono stati analizzati in triplo e la quantificazione è stata effettuata con il metodo dell’aggiunta dello standard.
Vantaggi dell’impiego di acqua ultrapura per le analisi di ormoni in campioni ambientali
Nelle analisi LC-MS non si può fare a meno di solventi di elevata qualità e privi di contaminanti che potrebbero causare interferenze. Anche se nell’acqua di rete di un laboratorio sono presenti le molecole di interesse dei ricercatori che ci lavorano, i sistemi Milli-Q® sono in grado di erogare acqua ultrapura priva di contaminanti organici e quindi idonea anche per le analisi LC-MS/MS più sensibili.
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Bibliografia
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