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細胞増殖・細胞維持

BrdU染色を使用したE4ニワトリ胚の眼の増殖細胞

細胞培養は、生物学的関連性の高いモデルの確立や、組換えタンパク質、ウイルス粒子、またはバイオ医薬品の生成を目的としたライフサイエンス研究で使用される基本的な手法です。細菌、酵母、哺乳類細胞などの培養細胞の増殖と維持は、微生物や化学物質による汚染を防ぐために適切な滅菌技術を使用して、バイオハザード対策用キャビネット(細胞または組織培養フードと呼ばれることが多い)で行われます。   

細胞培養の種類

哺乳類細胞培養の最もよく知られているアプローチは、初代培養と連続培養の2つです。初代培養は、ヒトまたは動物の組織に直接由来し、細胞の老化によって制限される培養寿命があります。連続培養は、患者のがん組織に由来することが多いため、培養条件下では「不死」と見なされます。また、細胞の不死化によって細胞株を作製することができ、それらは細胞分裂サイクルを繰り返す間、連続的に、そして際限なく、増殖または継代することができます。


関連技術資料

関連プロトコル

  • Cryopreservation efficacy which includes post-thaw recovery, viability, and functionality is of importance to both research and clinical applications. The cumulative stresses that result from the cryopreservation process and suboptimal freeze media result in cell death from necrosis and apoptosis.
  • Dilute fibronectin to the desired concentration. Optimum conditions for attachment are dependent on cell type and application. The typical coating concentration is 1 – 5 ug/cm2.Fibronectin coating protocol, products, and FAQs.
  • Discover our collection of primary human hepatic Kupffer cells and protocol for thawing, plating, and growing Kupffer cells. Find the formulation for Kupffer culture maintenance media.
  • Discover our collection of primary human hepatic sinusoidal endothelial cells, a protocol for thawing, plating, and growing HHSECs, and a recipe for our HHSEC maintenance media formulation.
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培養中の細胞の維持と増殖

細胞は、浮遊、もしくは組織培養フラスコやマルチウェルプレートに接着させて2D単層として培養することもできます。培養方法は、細胞の由来組織によって決まります。血液由来の細胞は一般的に浮遊状態で増殖しますが、固形組織由来の細胞は通常は単層で増殖します。

一般に、3D細胞培養モデル(オルガノイドおよびスフェロイド)は、2Dの平面で増殖した細胞よりも、細胞のin vivo環境をより厳密に模倣すると考えられています。スフェロイドは、多くの場合、がん細胞株または腫瘍生検(患者由来異種移植片、PDX)を超低接着表面プレートで浮遊させた状態で培養した細胞集合体として形成されるのに対し、オルガノイドは、一般的に組織幹細胞に由来し、それらをECMハイドロゲルマトリックス内に埋め込み、分化させたものです。

細胞増殖フェーズ

細胞培養研究から正確なデータを収集するには、適切な細胞増殖を確保することが重要です。細胞数は、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して判定できます(後者の場合に、より正確な細胞数が得られます)。

培養中の細胞増殖は一般的に次の4つのフェーズで起こります。

  1. 誘導期 – 細胞は培養環境に順応中で、分裂しません。
  2. 対数増殖期 – 細胞が活発に分裂しており、細胞数の増加の評価やデータ収集を行うのに最適な段階です。対数増殖期の後期は、細胞を継代(継代培養)するのに最も適した時期です。
  3. 定常期 – 細胞が100%のコンフルエントに近づくと増殖のペースが遅くなります。細胞の老廃物が蓄積して栄養分が枯渇すると、細胞がストレスや損傷を受けやすくなります。
  4. 減衰期 – 細胞死が優勢になるにつれて、生細胞の数が減少します。

細胞培養用培地・サプリメント・試薬

培養細胞は、増殖のために栄養素の供給を必要とします。哺乳類の細胞培養用培地は、生理的pHを維持し、また、塩類、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸と脂質、タンパク質とペプチド、微量元素、および成長因子をバランスよく供給する必要があります。ウシ胎児血清(FBS)は、これらの必須の細胞栄養素の多くを含み、培養中の細胞および組織の増殖をサポートすることが実証されているため、哺乳類の細胞培養に最も広く使用されている増殖サプリメントです。合成培地または動物由来成分の低減が必要になる用途の場合は、ゼノフリー培地が動物性由来物フリーの既知の組成を提供します。

培地やサプリメントは、日和見病原菌を増殖させる豊富な栄養素を提供することが多いため、細胞培養を成功させるためには、細胞死あるいはin vivo様の増殖を妨げる可能性のある汚染物質がないことを確認するための無菌技術と定期的な観察が必要です。顕微鏡で観察できない一般的な微生物汚染の場合は、マイコプラズマ検出試薬を使った定期的なスクリーニングにより、培養物や組織の増殖環境が保護されます。  

S. cerevisiaeP. pastoris(Pichia)のような酵母の培養は、組換えタンパク質発現と遺伝子機能の研究分野で一般的に利用されています。酵母培地製剤に通常含まれている重要な栄養素は、ペプトン、酵母エキス、デキストロースまたはグルコースです。

細胞継代のヒントとコツ

細胞の継代は、細胞の健康と最適な細胞増殖を維持するための、一般的な細胞培養における基本的なステップです。このチュートリアルでは、コンフルエンシーと細胞密度の重要性を含め、細胞継代のプロセスについて説明します。細胞継代のプロトコルには、細胞のモニタリングと計数、細胞のトリプシン処理や解離、および新しい培養器具への細胞の再播種などのプロセスが含まれます。

細胞培養環境と培養器具

培養細胞の増殖と処理には、組織培養フラスコとマルチウェルプレート、セロロジカルピペット、滅菌ボトルトップフィルター、滅菌シリンジフィルターなどの使い捨ての滅菌プラスチック器具が使用されます。プラスチックの組織培養フラスコおよびプレートは、通常、接着細胞が接着しやすいように親水性処理が施されています。2D平面培養に代わるものとして、微孔性膜ベースのプレートは、細胞遊走、細胞間コミュニケーション、細胞極性などの複雑な細胞アッセイに対して、より生理学的な増殖環境を提供します。

培養細胞は、由来元の生物におけるパラメーターを再現する温度および気体環境で維持する必要があります。細胞と培地を入れた培養容器は、通常、温度と混合気体を正確に制御するインキュベーターで維持します。ただし、マイクロ流体を採用した、連続培養での細胞イメージングを容易にする小規模ベンチトップインキュベーションシステムは、予測in vitroモデルとして最も信頼できる環境を提供します。




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