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タンパク質・核酸の相互作用

クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイワークフロー

タンパク質は細胞の中の主要分子であり、細胞が機能し生存するために行う無数の生物学的活動を担っています。興味深いことに、さまざまなタンパク質群がDNAとも相互作用します。染色体内のDNAは、束になってタンパク質にきつく巻き付いていることが多く、染色体内の染色分体と呼ばれます。これらのタンパク質-DNAの束は、DNAを細胞核内にコンパクトな形にまとめるのを助けます。強力な分子ツールおよび手法が研究者によって開発されており、これらのタンパク質-DNAの束やその他のDNA結合タンパク質複合体が単離され、さらなる下流アプリケーションに用いられています。

免疫沈降法

RNAおよびDNA結合タンパク質(転写因子など)に対する高特異性抗体を用いた免疫沈降法では、分子経路の調節を評価することや、健常組織と罹患組織両方における遺伝子機能の理解を深めることができます。

多数の技術や手法が、タンパク質-RNAおよびタンパク質-DNA相互作用の検討に利用されており、さらに下流の解析にも適しています。例えば、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイは、遺伝子発現やエピジェネティック修飾の研究における、転写因子-DNA相互作用の検討によく使用されます。一方、RNA免疫沈降(RIP)アッセイは、mRNA、ノンコーディングRNA、miRNA、ウイルスRNAへのタンパク質結合の検討によく使用されます。免疫沈降研究の一般的な課題は、目的のタンパク質に対する抗体の特異性やアクセスです。これらの問題の一部を回避するためには、組換えタンパク質技術を用いて、適切な抗体により高い特異性で認識される、ヘマグルチニン(HA)タグなどの固有のタグで修飾されたタンパク質を発現させます。

近接ライゲーションアッセイ技術

興味深いことに、タンパク質-DNA技術を活用する科学者たちは、タンパク質-タンパク質相互作用を評価するための新しいツールと方法を考案しました。高い特異性と感度をもつ近接ライゲーションアッセイ(PLA)技術によって、内在性タンパク質、タンパク質修飾、タンパク質相互作用のin situ検出が容易になっています。免疫沈降法と同様に、PLAアッセイでは、高特異性一次抗体を用いて、対象の2つのタンパク質を認識します。ただし、PLAプローブとして機能する修飾されたオリゴヌクレオチド標識二次抗体を、一次抗体への結合に使用します。両方のタンパク質が存在し、近接する場合のみ、ハイブリダイズするコネクターオリゴヌクレオチドがPLAプローブに結合します。リガーゼの添加により、閉じた環状DNAテンプレートが形成されます。環状DNAテンプレートが新たに形成されると、DNAポリメラーゼの添加によりローリングサークル増幅が可能であり、最終的には大幅に増幅したシグナルが生成され、PLAプローブに連結されます。適切なタンパク質-核酸相互作用技術の選択は、主に研究者の下流アプリケーションのニーズによって決まります。


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