ホームApplicationsタンパク質生物学ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティング実験。ウェスタンブロッティングによるタンパク質検出

ウェスタンブロッティングは、タンパク質の検出、分析、定量化を可能にする確立された分析手法です。この分析法は、組織ホモジネートや細胞溶解物などの複雑なサンプル中の特定のタンパク質分子を検出する目的で広く利用されています。ウェスタンブロッティングでは、通常、ゲル電気泳動によるタンパク質の分離と、それに続くポリフッ化ビニリデン(PVDF)またはニトロセルロースメンブレンへの転写が行われます。タンパク質を転写した後は、視覚化のために染色したり、N-末端配列解析、マススペクトル分析、免疫検出法により直接同定することができます。

ウェスタンブロッティング免疫検出では、タンパク質は特定の抗体への結合を通じて識別されます。通常は、一次抗体をHRPまたはAP結合二次抗体と組み合わせて使用して、適切な基質を用いた化学発光検出または比色検出を行います。または、蛍光標識された一次または二次抗体を使用して直接可視化することもできます。

ウェスタンブロッティングは、特定のタンパク質の存在の検出、翻訳後修飾の程度の判定、クローニング用途でのタンパク質発現の検証、抗体エピトープマッピングでのタンパク質とバイオマーカーの発現レベルの分析、臨床現場での疾病マーカーのテストなどの目的のために生化学の分野で広く使用されています。

より多くのタンパク質を限られたサンプルで同時に解析する必要があるため、ブロッティング手法の感度とスピードを改善するための継続的な研究が進められています。ダブルブロッティングは、非特異的な相互作用によって引き起こされる擬陽性を排除します。ファーウエスタンブロッティングでは、タンパク質間の特異的な相互作用を検出できます。サウスウエスタンブロッティングは、特定のDNA配列と相互作用するタンパク質を同定するために使用されます。マルチストリップブロッティングは、ブロット間のばらつきを最小化しながら、作業量を増加させます。また、シグナルの産生に必要なタンパク質の量を減らし、ウェスタンブロッティングの定量的検出力を向上させる新技術の開発も進められています。


関連技術資料

関連プロトコル


ワークフロー

Cell lysis of proteins for Western blotting.

タンパク質抽出

細胞や組織を取り扱う場合は、分析の前にサンプルを破砕し、タンパク質を分離しておく必要があります。溶解および抽出バッファーは、界面活性剤を使用して細胞壁と細胞膜を破壊し、タンパク質を放出します。最適なバッファーは、サンプルの種類と標的タンパク質の細胞内局在に基づいて選択する必要があります。

Gel electrophoresis chamber for running protein gels.

タンパク質ゲル電気泳動は、ブロッティングの前にタンパク質を分離して解析するために使用されます。調製したタンパク質混合物をポリアクリルアミドゲルで泳動し、分子量と電荷に基づいてタンパク質を分類します。

Transfer of proteins to PVDF membrane for detection using Western blotting techniques.

電気泳動によってゲル上で分離されたタンパク質は、PVDFまたはニトロセルロースメンブレンに転写することによって固定化されます。転写では、ゲルからメンブレンにタンパク質を引き寄せるために電流が使用されます(エレクトロブロッティング)。

Western blotting Detection of target protein using primary and HRP-conjugated secondary antibody with substrate.

標的タンパク質の検出には、一次抗体をHRPまたはAP結合二次抗体と組み合わせて、適切な化学発光基質または比色基質とともに使用するか、蛍光標識された一次抗体または二次抗体を使用します。