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ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティング実験。ウェスタンブロッティングによるタンパク質検出

ウェスタンブロッティングは、タンパク質の検出、分析、定量化を可能にする確立された分析手法です。この分析法は、組織ホモジネートや細胞溶解物などの複雑なサンプル中の特定のタンパク質分子を検出する目的で広く利用されています。ウェスタンブロッティングでは、通常、ゲル電気泳動によるタンパク質の分離と、それに続くポリフッ化ビニリデン（PVDF）またはニトロセルロースメンブレンへの転写が行われます。タンパク質を転写した後は、視覚化のために染色したり、N-末端配列解析、マススペクトル分析、免疫検出法により直接同定することができます。

ウェスタンブロッティング免疫検出では、タンパク質は特定の抗体への結合を通じて識別されます。通常は、一次抗体をHRPまたはAP結合二次抗体と組み合わせて使用して、適切な基質を用いた化学発光検出または比色検出を行います。または、蛍光標識された一次または二次抗体を使用して直接可視化することもできます。

ウェスタンブロッティングは、特定のタンパク質の存在の検出、翻訳後修飾の程度の判定、クローニング用途でのタンパク質発現の検証、抗体エピトープマッピングでのタンパク質とバイオマーカーの発現レベルの分析、臨床現場での疾病マーカーのテストなどの目的のために生化学の分野で広く使用されています。

より多くのタンパク質を限られたサンプルで同時に解析する必要があるため、ブロッティング手法の感度とスピードを改善するための継続的な研究が進められています。ダブルブロッティングは、非特異的な相互作用によって引き起こされる擬陽性を排除します。ファーウェスタンブロッティングでは、タンパク質間の特異的な相互作用を検出できます。サウスウェスタンブロッティングは、特定のDNA配列と相互作用するタンパク質を同定するために使用されます。マルチストリップブロッティングは、ブロット間のばらつきを最小化しながら、作業量を増加させることができます。また、シグナルの産生に必要なタンパク質の量を減らし、ウェスタンブロッティングの定量的検出力を向上させる新技術の開発も進められています。

関連技術資料

関連プロトコル

ワークフロー

Cell lysis of proteins for Western blotting.

タンパク質抽出

When working with cells or tissues, samples must be disrupted to isolate the proteins prior to analysis. Lysis and extraction buffers use detergents to break down cell walls and membranes to release the proteins. The optimal buffer should be chosen based on the sample type and sub-cellular localization of the target protein.

Gel electrophoresis chamber for running protein gels.

Protein gel electrophoresis is used to separate and resolve proteins prior to blotting. The prepared protein mixture is run on a polyacrylamide gel to sort proteins by molecular weight and charge.

Transfer of proteins to PVDF membrane for detection using Western blotting techniques.

The proteins separated on the gel by electrophoresis are immobilized by transfer onto a PVDF or nitrocellulose membrane. The transfer uses electric current to pull proteins from the gel onto the membrane (electroblotting).

Western blotting Detection of target protein using primary and HRP-conjugated secondary antibody with substrate.

Target protein is detected using a primary antibody in combination with an HRP- or AP-conjugated secondary antibody and an appropriate chemiluminescent or colorimetric substrate, or by using fluorescently-labeled primary or secondary antibody.

関連アプリケーション

ゲル電気泳動
ゲル電気泳動は、タンパク質の精製、検出、同定のためにタンパク質を分離する方法です。ウエスタンブロット、質量分析およびプロテオミクス解析などの下流工程での用途に向けた調製において、ネイティブPAGE、SDS-PAGE、二次元PAGEおよび等電点電気泳動（IEF）などの方法を使用します。
溶解・タンパク質抽出
界面活性剤可溶化、凍結融解溶解、浸透圧ショック、超音波処理、酵素細胞溶解、および、機械的破砕技術（ダウンス、ポリトロン、乳鉢と乳棒によるホモジナイズなど）を含む細胞溶解とタンパク質抽出法の概要。
ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）
特異的抗原を特定・定量するELISA（酵素免疫測定法）には、直接法、間接法、およびサンドイッチ法があります。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、個々の細胞のマルチパラメータ解析を可能にする、分子生物学および細胞生物学の強力なツールです。
タンパク質質量分析
創薬およびプロテオミクス研究において、タンパク質の同定および定量、翻訳後修飾、グリカン分析、タンパク質間相互作用に使用されるタンパク質質量分析の手法の概要
タンパク質発現
基礎研究および治療法とワクチン生産のサポートのための大腸菌、昆虫、酵母、および哺乳類の発現システムで組換えタンパク質を発現させるためのタンパク質発現技術。
タンパク質定量
さまざまなサンプルのタンパク質濃度を正確に測定するためのタンパク質定量法、試薬、イムノアッセイ技術

関連製品分野

トランスファーメンブレン・キット
標的タンパク質の大きさ、アプリケーション、検出方法、利便性に基づき、最適なウェスタンブロッティングおよびタンパク質イムノブロッティング性能が得られるように、各種Immobilon® PVDFメンブレンからお選びください。
検出用基質・酵素
基質・酵素は、検出システムのツールおよび標的として、ライフサイエンス研究においてきわめて重要です。ELISA、免疫組織染色、ウェスタンブロッティングなどのための、酵素ベースのタンパク質検出システムについては、私たちの検出用基質・酵素の多様なポートフォリオをご覧ください。
タンパク質電気泳動用ゲル・バッファー
PAGE、SDS-PAGEタンパク質ゲル電気泳動用のプレキャストポリアクリルアミドタンパク質ゲル、ランニングバッファー、ポリアクリルアミドゲルを手動で注入するためのハンドキャスティング試薬です。
タンパク質ゲル電気泳動・転写装置 | Sigma-Aldrich
タンパク質ゲル電気泳動と湿式・セミドライ式転写のための電気泳動槽、ブロッティングシステムおよび電源装置です。
プロテインマーカー
タンパク質ゲル電気泳動、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティングアプリケーション用の着色済み・未着色の分子量マーカーです。
タンパク質電気泳動法用ゲル染色剤
ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、PVDF、ニトロセルロースメンブレンに適した、高感度の比色・蛍光タンパク質ゲル染色剤、固定液および脱染試薬です。
メンブレン免疫検出デバイス
ウェスタンブロットのブロッキング、抗体結合および洗浄用の免疫検出デバイスを使用することにより、ウェスタンブロッティングのワークフローを簡素化し、時間を節約することができます
Milli-Q®ラボ用超純水・純水製造装置
お客様のラボのニーズに合った超純水・純水製造装置を見つけてください。Milli-Q®超純水・純水製造装置は、お客様の用途、水質、使用量、スペースおよび予算の要件を満たします。

ハイライト

Protein Blotting Handbook
タンパク質ブロッティングハンドブック

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