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ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティング実験。ウェスタンブロッティングによるタンパク質検出

ウェスタンブロッティングは、タンパク質の検出、分析、定量化を可能にする確立された分析手法です。この分析法は、組織ホモジネートや細胞溶解物などの複雑なサンプル中の特定のタンパク質分子を検出する目的で広く利用されています。ウェスタンブロッティングでは、通常、ゲル電気泳動によるタンパク質の分離と、それに続くポリフッ化ビニリデン(PVDF)またはニトロセルロースメンブレンへの転写が行われます。タンパク質を転写した後は、視覚化のために染色したり、N-末端配列解析、マススペクトル分析、免疫検出法により直接同定することができます。

ウェスタンブロッティング免疫検出では、タンパク質は特定の抗体への結合を通じて識別されます。通常は、一次抗体をHRPまたはAP結合二次抗体と組み合わせて使用して、適切な基質を用いた化学発光検出または比色検出を行います。または、蛍光標識された一次または二次抗体を使用して直接可視化することもできます。

ウェスタンブロッティングは、特定のタンパク質の存在の検出、翻訳後修飾の程度の判定、クローニング用途でのタンパク質発現の検証、抗体エピトープマッピングでのタンパク質とバイオマーカーの発現レベルの分析、臨床現場での疾病マーカーのテストなどの目的のために生化学の分野で広く使用されています。

より多くのタンパク質を限られたサンプルで同時に解析する必要があるため、ブロッティング手法の感度とスピードを改善するための継続的な研究が進められています。ダブルブロッティングは、非特異的な相互作用によって引き起こされる擬陽性を排除します。ファーウェスタンブロッティングでは、タンパク質間の特異的な相互作用を検出できます。サウスウェスタンブロッティングは、特定のDNA配列と相互作用するタンパク質を同定するために使用されます。マルチストリップブロッティングは、ブロット間のばらつきを最小化しながら、作業量を増加させることができます。また、シグナルの産生に必要なタンパク質の量を減らし、ウェスタンブロッティングの定量的検出力を向上させる新技術の開発も進められています。


関連技術資料

関連プロトコル


ワークフロー

Cell lysis of proteins for Western blotting.

タンパク質抽出

When working with cells or tissues, samples must be disrupted to isolate the proteins prior to analysis. Lysis and extraction buffers use detergents to break down cell walls and membranes to release the proteins. The optimal buffer should be chosen based on the sample type and sub-cellular localization of the target protein.

Gel electrophoresis chamber for running protein gels.

Protein gel electrophoresis is used to separate and resolve proteins prior to blotting. The prepared protein mixture is run on a polyacrylamide gel to sort proteins by molecular weight and charge.

Transfer of proteins to PVDF membrane for detection using Western blotting techniques.

The proteins separated on the gel by electrophoresis are immobilized by transfer onto a PVDF or nitrocellulose membrane. The transfer uses electric current to pull proteins from the gel onto the membrane (electroblotting).

Western blotting Detection of target protein using primary and HRP-conjugated secondary antibody with substrate.

Target protein is detected using a primary antibody in combination with an HRP- or AP-conjugated secondary antibody and an appropriate chemiluminescent or colorimetric substrate, or by using fluorescently-labeled primary or secondary antibody.





ハイライト

Protein Blotting Handbook
タンパク質ブロッティングハンドブック

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