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ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティング実験。ウェスタンブロッティングによるタンパク質検出

ウェスタンブロッティングは、タンパク質の検出、分析、定量化を可能にする確立された分析手法です。この分析法は、組織ホモジネートや細胞溶解物などの複雑なサンプル中の特定のタンパク質分子を検出する目的で広く利用されています。ウェスタンブロッティングでは、通常、ゲル電気泳動によるタンパク質の分離と、それに続くポリフッ化ビニリデン（PVDF）またはニトロセルロースメンブレンへの転写が行われます。タンパク質を転写した後は、視覚化のために染色したり、N-末端配列解析、マススペクトル分析、免疫検出法により直接同定することができます。

ウェスタンブロッティング免疫検出では、タンパク質は特定の抗体への結合を通じて識別されます。通常は、一次抗体をHRPまたはAP結合二次抗体と組み合わせて使用して、適切な基質を用いた化学発光検出または比色検出を行います。または、蛍光標識された一次または二次抗体を使用して直接可視化することもできます。

関連技術資料

関連プロトコル

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ウェスタンブロッティングは、特定のタンパク質の存在の検出、翻訳後修飾の程度の判定、クローニング用途でのタンパク質発現の検証、抗体エピトープマッピングでのタンパク質とバイオマーカーの発現レベルの分析、臨床現場での疾病マーカーのテストなどの目的のために生化学の分野で広く使用されています。

より多くのタンパク質を限られたサンプルで同時に解析する必要があるため、ブロッティング手法の感度とスピードを改善するための継続的な研究が進められています。ダブルブロッティングは、非特異的な相互作用によって引き起こされる擬陽性を排除します。ファーウェスタンブロッティングでは、タンパク質間の特異的な相互作用を検出できます。サウスウェスタンブロッティングは、特定のDNA配列と相互作用するタンパク質を同定するために使用されます。マルチストリップブロッティングは、ブロット間のばらつきを最小化しながら、作業量を増加させることができます。また、シグナルの産生に必要なタンパク質の量を減らし、ウェスタンブロッティングの定量的検出力を向上させる新技術の開発も進められています。

ワークフロー

ウェスタンブロッティングのための細胞溶解したタンパク質。

タンパク質抽出

細胞や組織を取り扱う場合は、分析の前にサンプルを破砕し、タンパク質を分離しておく必要があります。溶解および抽出バッファーは、界面活性剤を使用して細胞壁と細胞膜を破壊し、タンパク質を放出します。最適なバッファーは、サンプルの種類と標的タンパク質の細胞内局在に基づいて選択する必要があります。

タンパク質ゲルを泳動させる電気泳動槽。

タンパク質ゲル電気泳動は、ブロッティングの前にタンパク質を分離して解析するために使用されます。調製したタンパク質混合物をポリアクリルアミドゲルで泳動し、分子量と電荷に基づいてタンパク質を分類します。

ウェスタンブロッティングを用いた検出のためのPVDFメンブレンへのタンパク質の転写。

電気泳動によってゲル上で分離されたタンパク質は、PVDFまたはニトロセルロースメンブレンに転写することによって固定化されます。転写では、ゲルからメンブレンにタンパク質を引き寄せるために電流が使用されます（エレクトロブロッティング）。

一次抗体およびHRP結合二次抗体と基質を用いた標的タンパク質のウェスタンブロッティングによる検出。

標的タンパク質の検出には、一次抗体をHRPまたはAP結合二次抗体と組み合わせて、適切な化学発光基質または比色基質とともに使用するか、蛍光標識された一次抗体または二次抗体を使用します。

関連アプリケーション
ゲル電気泳動
ゲル電気泳動は、タンパク質の精製、検出、同定のためにタンパク質を分離する方法です。ウエスタンブロット、質量分析およびプロテオミクス解析などの下流工程での用途に向けた調製において、ネイティブPAGE、SDS-PAGE、二次元PAGEおよび等電点電気泳動（IEF）などの方法を使用します。
溶解・タンパク質抽出
界面活性剤可溶化、凍結融解溶解、浸透圧ショック、超音波処理、酵素細胞溶解、および、機械的破砕技術（ダウンス、ポリトロン、乳鉢と乳棒によるホモジナイズなど）を含む細胞溶解とタンパク質抽出法の概要。
ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）
特異的抗原を特定・定量するELISA（酵素免疫測定法）には、直接法、間接法、およびサンドイッチ法があります。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、個々の細胞のマルチパラメータ解析を可能にする、分子生物学および細胞生物学の強力なツールです。
タンパク質質量分析
創薬およびプロテオミクス研究におけるタンパク質の同定および定量、翻訳後修飾、グリカン分析、タンパク質間相互作用に使用されるタンパク質質量分析の手法の概要
タンパク質発現
基礎研究および治療法とワクチン生産のサポートのための大腸菌、昆虫、酵母、および哺乳類の発現システムで組換えタンパク質を発現させるためのタンパク質発現技術。
タンパク質定量
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関連製品分野
トランスファーメンブレン・キット
標的タンパク質の大きさ、アプリケーション、検出方法、利便性に基づき、最適なウェスタンブロッティングおよびタンパク質イムノブロッティング性能が得られるように、各種Immobilon® PVDFメンブレンからお選びください。
検出用基質・酵素
基質・酵素は、検出システムのツールおよび標的として、ライフサイエンス研究においてきわめて重要です。ELISA、免疫組織染色、ウェスタンブロッティングなどのための、酵素ベースのタンパク質検出システムについては、私たちの検出用基質・酵素の多様なポートフォリオをご覧ください。
タンパク質電気泳動用ゲル・バッファー
PAGE、SDS-PAGEタンパク質ゲル電気泳動用のプレキャストポリアクリルアミドタンパク質ゲル、ランニングバッファー、ポリアクリルアミドゲルを手動で注入するためのハンドキャスティング試薬です。
タンパク質ゲル電気泳動・転写装置
タンパク質ゲル電気泳動とウェット式・セミドライ式転写のための電気泳動槽、ブロッティングシステムおよび電源装置です。
プロテインマーカー
タンパク質ゲル電気泳動、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティングアプリケーション用の着色済み・未着色の分子量マーカーです。
タンパク質電気泳動法用ゲル染色剤
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メンブレン免疫検出デバイス
ウェスタンブロットのブロッキング、抗体結合および洗浄用の免疫検出デバイスを使用することにより、ウェスタンブロッティングのワークフローを簡素化し、時間を節約することができます
Milli-Q®ラボ用超純水・純水製造装置
お客様のラボのニーズに合った超純水・純水製造装置を見つけてください。Milli-Q®超純水・純水製造装置は、お客様の用途、水質、使用量、スペースおよび予算の要件を満たします。

ハイライト

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