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プロテクターRNase阻害剤のプロトコルとトラブルシューティング

プロテクターRNase阻害剤RNAINH-RO)は、RNase A、RNase B、RNase T2などの幅広いRNaseを不活性化します。このRNase阻害剤は、望ましい結果がRNaseによって妨げられる可能性のある用途において、RNaseによる分解を防ぐのに役立ちます。

RNase活性の阻害

RT-PCRやin vitro転写反応などの精製RNAおよびRNA反応ミックスにプロテクターRNase阻害剤を加えます。

細胞ペレット:プロテクターRNase阻害剤は50 kDaのタンパク質であり、無傷細胞にはおそらく浸透しません。そのため、細胞ペレットにプロテクターRNase阻害剤を添加することはお勧めしません。RNAを安定化するには、細胞ペレットを-80℃で直ちに凍結するだけで十分です。プロテクターRNase阻害剤は-80℃では不活性です。

細胞溶解液:高純度RNA分離キットを使用してRNAを分離する前に、細胞溶解液にプロテクターRNase阻害剤を添加することはお勧めしません。高純度RNA分離キットの細胞溶解バッファーにはRNase阻害化合物が含まれており、これらのタンパク質変性化合物がプロテクターRNase阻害剤を不活性化します。

トラブルシューティング

初代単核細胞:初代単核細胞にはプロテクタープロテアーゼ阻害剤を直接添加しないでください。

初代細胞と不死化培養細胞株は大きく異なります。不死化培養細胞は、代謝、細胞サイズ、細胞密度が異なり、増殖速度がはるかに高いため、RNAの内因性含有量が多くなります。増殖速度はタンパク質合成に関連しているため、培養細胞は通常、初代細胞よりも多くのリボソームを含有しています。総RNAの大部分はリボソームRNAであり、このことは、培養細胞からのRNA収量がはるかに高いことと一致しています。そのため、総RNAを分離する代わりにmRNA分離手順を用いるのが効果的な場合があります。

細胞を採取してからRNA分離を行うまでの期間を短くすることをお勧めします。リポ多糖とのインキュベーション期間が終了したらすぐに、細胞を氷冷PBSで洗浄して、代謝活性を最小限に抑えます。細胞が溶解バッファーで溶解するまで、細胞培養バイアルとプレートを氷上に置いたままにします。

 

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