オリゴヌクレオチドのアニーリングプロトコル

このプロトコルは、相補的配列を有する2つの一本鎖オリゴヌクレオチドのアニーリングに関するものです（図1）。加熱後に冷却を行うことで、ハイブリダイゼーションを促進します。

略称の説明

EDTA：エチレンジアミン四酢酸

NaCl：塩化ナトリウム

Trizma^®base：Tris［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］のブランド名

オリゴ：オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの略語。オリゴヌクレオチドは、短い一本鎖DNAまたはRNA分子であり、相補的DNAまたはRNA鎖と結合して二本鎖を形成するには、アニール（加熱または融解）する必要があります。

DNAアニーリング：このページでは、すべてのオリゴヌクレオチドのアニーリング工程を紹介します。アニーリングは、RNAにも同様に使用される工程でもありますが、DNAアニーリングと呼ばれることがあります。アニーリングとは、相補的配列を有する2つの一本鎖オリゴヌクレオチドを加熱・冷却して二本鎖を形成させる工程です。加熱によってすべての水素結合が切断され、冷却によって配列間に新しい結合が形成されます。

DNA/RNAアニーリングの装置と消耗品

• ・ヒートブロックまたはサーマルサイクラー
• ・2mL遠心チューブ
• ・ピペットチップ
• ・Milli-Q^®H₂O
• ・EDTA（製品番号 E9884）
• ・NaCl（製品番号 S3014）
• ・Trizma^® Base（製品番号 93362）
• ・相補的配列を有する2つの一本鎖オリゴヌクレオチド

DNA/RNAアニーリング法

アニーリング工程は、ヒートブロックまたはサーマルサイクラーのいずれかによる1）溶解、2）アニーリングの2つの主要ステップに分けられます。

オリゴの溶解

各オリゴヌクレオチドはあらかじめ分量が測定された状態で納品されますが、最良の結果を得るために、反応ごとに各オリゴヌクレオチドを確実に等量ずつ加えられるよう、分光光度計で量を確認してください。

• ・各オリゴヌクレオチドを所定量のアニーリングバッファー（バッファーの組成は下記参照）に溶解し、それぞれ同じ濃度になるようにします。
• ・各オリゴヌクレオチドの濃度は、目的とする二本鎖オリゴヌクレオチドの濃度の2倍である必要があります。

例

目的とする二本鎖オリゴヌクレオチドの濃度は50µMです。

1. 1.　オリゴヌクレオチド1：10.55OD（312.6µg、49.9 nmol）で供給；分光光度計によりOD測定値を確認します。
2. 2.　オリゴヌクレオチド2：9.04OD（279.7µg、45.9 nmol）で供給；分光光度計によりOD測定値を確認します。
3. 3.　各オリゴヌクレオチドのストック溶液の濃度は、目的とする二本鎖オリゴヌクレオチドの濃度の2倍である必要があります。つまり、各ストック溶液は100µMでなければなりません。
   1. a.オリゴヌクレオチド1には、49.9×10＝499µLのアニーリングバッファーを加えて100µMのストック溶液を調製します。
   2. b.オリゴヌクレオチド2には、45.9×10＝459µLのアニーリングバッファーを加えて100µMのストック溶液を調製します。

*この計算は簡略化しており、100µMの溶液を調製する場合にのみ使用できます。ここでは具体例として使用しています。

オリゴのアニーリング

ヒートブロック

1. 1.　等モル濃度のオリゴヌクレオチドを等量ずつマイクロチューブに加えて撹拌します。
2. 2.　マイクロチューブを95℃で5分間インキュベートします。
3. 3.　マイクロチューブをゆっくりと室温まで冷却させます（60分未満）。

サーマルサイクラー

ヒートブロックでもアニーリングは可能ですが、サーマルサイクラーではより工程の一貫性が保てます。

1. 1.　等モル濃度のオリゴヌクレオチドを等量ずつPCRチューブに加えて撹拌します。
2. 2.　以下の温度プロファイルを使用します：
   1. a.　95℃まで加熱後、2分間保温
      
   2. b. 45分間かけて25℃まで冷却
      
   3. c.一時的に4℃まで冷却
3. 3.　PCRチューブを短時間遠心分離機にかけ、蓋に残らないようにします。

ヒートブロックまたはサーマルサイクラーの使用後、二本鎖オリゴヌクレオチドは使用または保管が可能な状態になっています。オリゴヌクレオチドの保管に関する詳細は、「取扱いガイドラインと安定性（Handling Guidelines & Stability）」をご参照ください。

DNAアニーリング用バッファーの組成

バッファーはすべてMilli-Q^®水で調製してください。

アニーリングバッファーの組成（1倍）

• ・10mM Tris、pH7.5～8.0
• ・50mM NaCl
• ・1mM EDTA

リガーゼバッファーの組成（1倍）

このバッファーは主にT4 DNAリガーゼとともに使用します。

• ・50mM Tris-HCl、pH7.5
• ・10mM MgCl₂
• ・1mM ATP
• ・10mM DTT

キナーゼバッファーの組成（1倍）

このバッファーは主にT4ポリヌクレオチドキナーゼとともに使用します。

• ・70mM Tris-HCl、pH7.6
• ・10mM MgCl₂
• ・5mM DTT