標準PCRプロトコル

PCRの方法

標準的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のセットアップは以下の4つのステップで構成されています:

1. 必要な試薬またはマスターミックスとテンプレートをPCRチューブに加える。
   *加熱蓋のないサーマルサイクラーでは、蒸発を防ぐためにミネラルオイルを加えます。
2. サーマルサイクラーとプライマーのパラメーターに従って増幅します。
3. アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色によって増幅DNAを評価します。

これらの手順を、材料と試薬選択のヒントとともに、より詳細に以下に示す。これはTaq DNAポリメラーゼを用いた基本的なPCRプロトコールである。

PCR Steps and Essential PCR Components

PCR反応のトラブルシューティングには多くの要素が含まれます。このアニメーションを見ながら、ニーズに合ったコンポーネントとサイクリング条件を選択することで、どのように最適な結果を得ることができるかを学びましょう。

プロトコルのPCR技術ガイドのセクションで、他のポリメラーゼや高度なPCR技術に関する追加のプロトコルを見つけてください。

標準的なPCRについては、PCR Basics page.

試薬：PCRには何が必要ですか？

PCRで使用する試薬	推奨製品
TaqDNA polymerase	ユーザーの好みに応じて選択してください。(下記のTaq ポリメラーゼの表 を参照してください。)
PCR grade water	PCR試薬水
作業濃度まで希釈したプライマー	10μMの作業ストックはほとんどのアッセイに十分です。
オリゴ	カスタムオリゴ
増幅されるDNA
DNA-oligos-and-qpcr-probes.研究者より提供
専用ピペット
	サーマルサイクラー	様々なウェルブロックサイズまたはマルチフォーマット
滅菌済みフィルターピペット
1.5 mL スクリュートップ微量遠心チューブ	コーニング® スクリューキャップ付き微量遠心チューブ
滅菌済み1.
PCRチューブまたはプレート	サイクラーに合わせてお選びください：
	Individual thin-walled 200 µL PCR tubes
	200 µLストリップチューブ
	；マルチウェルプレートとプレートシール
dNTP mix	Deoxynucleotide mix ；containing 10 mM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP *readymixes already include dNTPs

Taq ポリメラーゼとは何ですか？

Taq DNA ポリメラーゼは、好熱性細菌であるThermus aquaticusに由来する耐熱性酵素です。  は一般にPCRでDNA断片を増幅するのに用いられる。この酵素は組換え型で、大腸菌で発現する。この酵素は、（PCR法で要求される）95℃への繰り返しの加熱にも、活性を著しく失うことなく耐えることができる。酵素の分子量はSDS-PAGEで約94kDaで、エンドヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼ活性は検出されない。5'→3'DNAポリメラーゼ活性と5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有する。各ロットのTaq DNA Polymeraseは、PCR増幅および二本鎖シーケンシング用に試験されています。酵素は5 ユニット/µLで供給され、最適化された10x反応バッファーが付属しています。

Standard Taq <DNA ポリメラーゼ

下の表を参考に、反応条件に適したTaq DNAポリメラーゼを選択してください。塩化マグネシウム(MgCl₂)の有無にかかわらず、透明または赤色に染色された製剤、またはバッファーとdNTPsを含む調製済みのレディミックスまたはマスターミックスからお選びください。

MgCl2を含む＆。		MgCl2を分離	レディミックス
染料無添加のクリアタイプ	ゲルに直接塗布する赤色染料入り	染料無添加のクリアタイプ<	ゲルに直接ロードするための赤色染料付き	染料なしのクリア製剤
Taq DNA Polymerase from&?(D1806)	REDTaq® >DNA ポリメラーゼ (D4309)	Taq DNA ポリメラーゼ	REDTaq® > ReadyMix™ ；PCR Reaction Mix (R2523)	ReadyMix™ Taq PCRリアクションミックス (P4600)

単位定義：1単位は、74℃で30分間で、10nmolの全デオキシリボヌクレオシド三リン酸を酸沈殿性DNAに組み込みます。

手順：PCR のステップ

Taq DNAポリメラーゼ、鋳型DNA、プライマー、MgCl₂の濃度の最適条件は、利用するシステムによって異なる。各成分の最適条件を決定する必要があるかもしれない。これは特にTaqDNAポリメラーゼ、サイクリングパラメーター、MgCl₂濃度に当てはまる。

1. 試薬を適切な大きさのチューブに、表の順序で加える。(反応のセットアップに適切な表を選択する。標準試薬またはレディミックス試薬。) 多数の反応を行う場合は、テンプレートを含まないマスターミックスをセットアップし、反応チューブに分注する。最後にテンプレートを適切なチューブに加える。

分量	成分	最終濃度
w µL	水
5 µL	10x PCR Buffer (P2192 ；またはP2317)*	1倍
10x PCR Buffer (P2192 )tr>	1μL	デオキシヌクレオチドミックス	200 µM
w µL	順方向プライマー （通常15-30塩基長）	0.1-0.5 µM
x µL	0.valign="top">逆プライマー （通常15-30塩基長）	0.1-0.5 µM
0.5 µL	Taq DNA Polymerase*	0.05 units/µL
y µL		200 pg/µL
z µL	25 mM MgCl2	0.1-0.5 mM
50 µL	総反応量

*バッファーとTaqポリメラーゼを一緒に購入してください： D1806, D4309 または D4545

レディミックスPCR反応

分量	成分	最終濃度
25 µL	Readymix (R2523 or ；P4600)
w µL	フォワードプライマー （通常15-30塩基長）	0.1-0.5 µM
x µL	0.valign="top">逆プライマー （通常15-30塩基長）	0.1-0.5 µM
y µ?L	鋳型DNA（通常10 ng）	鋳型DNA（通常10 ngbr>	200 pg/µL
z µL	水
50μL	総反応量

2. ボルテックスで穏やかに混合し、短時間遠心して全成分をチューブの底に集める。

注意：加熱蓋のないサーマルサイクラーを使用する場合は、蒸発を防ぐために各チューブの上部に50μLのミネラルオイルを加える。

3. 増幅 増幅パラメーターは、使用するプライマーやサーマルサイクラーによって異なります。

典型的なサイクルパラメーター

25～30サイクルの増幅を推奨します。

PCR Step	Temperature °C	Duration
変性テンプレート		94 °C	1分
プライマーのアニール	1 分
1 分	2分
アニール	エクステンション	72 °C	3分

4.増幅されたDNAは、agarose gel electrophoresis and subsequent ethidium bromide staining.

      Note: Mineral oil overlay may be removed by a single chloroform extraction (1:1), recovering the aqueous phase.

• アガロース
• （プレキャストゲル、パウダーなど。
• MOPS-EDTA-酢酸ナトリウム、トリス-酢酸-EDTA（TAE）、トリス-ホウ酸-EDTA（TBE）などのバッファー
• ゲルローディング液、サンプルローディングバッファー。ゲルローディング溶液およびRNA用サンプルローディングバッファー
• 電気泳動染色剤または色素（臭化エチジウムなど）

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レーベル ライセンス ステートメント

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材料

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