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Duolink® PLA蛍光検出プロトコル

このプロトコルは、組織や細胞サンプル中の個々のタンパク質、タンパク質の修飾、およびタンパク質の相互作用を免疫蛍光で検出、可視化、および定量化にDuolink® PLA試薬を用いる方法について説明しています。Duolink® PLA法の詳細については、ガイドブック『Duolink®PLA近接ライゲーションアッセイの最適化』をご覧ください。その他のプロトコルについては、『Duolink® PLA Brightfieldプロトコル』および 『Duolink® PLA Probemakerユーザーガイド』をご覧ください。

試薬・器具
Duolink® PLA蛍光検出プロトコル
結果
トラブルシューティング
参考文献

試薬・器具

Duolink® PLA試薬

具体的な製品については『Duolink® PLA製品選択ガイド』をご覧ください。蛍光検出でDuolink® PLA 実験を行うためには、以下のDuolink® PLA 製品が必要です：

  1. Duolink® PLAプローブ（お手持ちの一次抗体の宿主種に合わせた、異なる種由来のプラスおよびマイナスを1つずつ）。各キットには以下が同梱されています：
    1. PLAプローブ（5x）－プラスおよび／またはマイナス（製品による）
    2. ブロッキング溶液－抗体のインキュベーション前にサンプルをブロッキングする
    3. 抗体希釈液－PLAプローブおよび一次抗体を希釈する。
    注記：キット同梱品はすべて4℃で保管してください。

    注記：ご希望の抗体にプローブを自家調製できるDuolink® Probemakerプラスおよびマイナスキットもご利用いただけます。詳細はProbemakerガイドをご覧ください。

  2. Duolink® 蛍光検出試薬（緑、オレンジ、赤、および遠赤から選択）。各キットには以下が同梱されています：
    1. ライゲーション試薬（5x）－希釈し、1xライゲーションバッファーに調製する
    2. リガーゼ（1 U/μL）－ライゲーション溶液に添加する
    3. 増幅試薬（5x）－希釈し、1x増幅バッファーに調製する
    4. ポリメラーゼ（10 U/μL）－増幅試薬に添加する
    注記：キット同梱品はすべて−20℃で保管してください。
  3. 蛍光検出用洗浄バッファー（AおよびB）
  4. Duolink® DAPI含有マウントメディウム （スライド上で使用、2～8℃で保存）または 核染色および褪色防止試薬 （マイクロプレートで使用、−20℃で保存）

ほかに必要な試薬

  1. 対象タンパク質検出用に選択した一次抗体。Duolink® PLAプローブと併用するには、マウス、ウサギ、ヤギまたはヒト由来で作成されたもの。
  2. 高純度水（ろ過滅菌水、Milli-Q®、または同等品）
  3. サンプル（細胞または組織）をスライドに載せ、固定、抗原回復、透過処理の前処理をします。下記に関するおすすめや詳細については、『Duolink®近接ライゲーションアッセイの最適化』をご覧ください。
    1. 実験デザイン・コントロール
    2. 一次抗体の選択・最適化
    3. サンプルの処理

器具

  1. 適切なフィルター、カメラ、画像取得用のカメラソフトウェアを付属した蛍光顕微鏡
  2. インキュベーター（37℃）
  3. オービタルシェーカー
  4. 加温加湿チャンバーまたはMicroplate Heat Transfer Block
  5. 反応領域を区切る疎水性のペン
  6. 保冷剤（酵素用）
  7. 染色ジャー
  8. ピンセット
  9. ピペット・チップ類（容量範囲1～1,000 μL）
  10. 蛍光顕微鏡観察に対応したカバーガラス

Duolink® PLA 蛍光検出プロトコル

下記プロトコルはスライド1枚にサンプル1 cm2を載せた場合で、この面積に必要十分な試薬液量は40 µLです。反応面積およびサンプル数に応じて量を調整してください。インキュベーションはすべて加湿環境下で行ってください。洗浄ステップはすべて、染色バットにバッファー70 mL以上を入れ、室温で穏やかに攪拌しながら行ってください。

試薬の調製

  1. 洗浄バッファーAおよびBはパウチ1袋分を高純度水に溶かし、最終容量が1000 mLになるように、アッセイ前に調製してください。溶液は室温で短期間（2週間未満）または4℃で長期保存可能です。注記：溶液は室温に戻してからご使用ください。
  2. 0.01x 洗浄バッファーBはアッセイ開始前に1x 洗浄バッファーBを高純度水で1：100の割合で希釈して調製してください。
  3. Duolink® PLA試薬の多くは濃縮濃度で提供しており、使用直前に希釈する必要があります。希釈後のDuolink® PLA試薬は保存しないでください。

Duolink® PLAプロトコル

開始前に、サンプルをスライドガラス上に置き、固定、抗原回復、透過処理の前処理を行います。詳細は『Duolink®近接ライゲーションアッセイの最適化』をご覧ください。

  1. ブロッキング
    1. Duolink®ブロッキング溶液をよく混合します。
    2. サンプル1 cm<sup>2</sup>当たりDuolink®ブロッキング溶液1滴（約40 µL）を添加します。サンプル全体にブロッキング溶液が被覆するようにしてください。
    3. スライドを加湿チャンバーに入れ、37℃で60分間インキュベートします。
  2. 一次抗体インキュベーション 注記：抗体添加前にスライドが乾かないようにしてください。バックグラウンドが生じる恐れがあります。
    1. Duolink®抗体希釈液をよく混合します。
    2. 手持ちの一次抗体または抗体をDuolink®抗体希釈液で目的の濃度に希釈します。
    3. スライドをタップしてDuolink®ブロッキング溶液を除去します。
    4. 各サンプルに一次抗体溶液を添加します。
    5. スライドを加湿チャンバーでインキュベートします。一次抗体に対して最適な温度と時間でインキュベーションを行ってください。
  3. Duolink® PLAプローブインキュベーション
    1. プラスおよびマイナスPLAプローブをよく混合します。
    2. プラスおよびマイナスPLAプローブをDuolink®抗体希釈液で1：5の割合で希釈します。
      反応液を40 µLとした場合、PLAプローブマイナスストック液8 µL、PLAプローブプラスストック液8 µL、および抗体希釈液24 µLが必要です。どのサンプルについても十分量の溶液を調製してください。
    3. スライドをタップして一次抗体溶液を除去します。
    4. 1x 洗浄バッファーAでスライドを室温で5分間 × 2回洗浄します。
    5. 余分な洗浄バッファーをタップして落とし、PLAプローブ溶液を添加します。
    6. 37℃に予熱した加湿チャンバーで1時間インキュベートします。
  4. ライゲーション
    注記：サンプル添加の直前までリガーゼを添加しないでください。ライゲーションバッファーを完全に解凍し、よく混ぜてからご使用ください。
    1. 5x 濃縮Duolink®ライゲーションバッファーを高純度水に1：5の割合で希釈し、混ぜます。
      反応液40 µLの場合、5x 濃縮ライゲーションバッファー8 µLを高純度水32 µLに加えます。サンプル溶液はすべて十分な量を調製してください。
    2. スライドを軽く叩いてPLAプローブ溶液を除去します。
    3. 1x 洗浄バッファーAでスライドを室温にて5分間 × 2回洗浄します。
    4. 洗浄中に、冷凍庫からリガーゼを取り出し、フリーザーブロック（−20℃）を使い保管します。
    5. リガーゼをステップ（a）の1x ライゲーションバッファーで1：40の割合で希釈し、混ぜます。
      ライゲーション溶液40 µLの場合、リガーゼ1 µLを1x ライゲーションバッファー39 µLに添加します。
    6. スライドを軽く叩いて余分な洗浄バッファーを除去し、ライゲーション溶液を添加します。
    7. 37℃に予熱した加湿チャンバーでスライドを30分間インキュベートします。
  5. アプリケーション
    注記：サンプル添加の直前までポリメラーゼを添加しないでください。増幅バッファーは光に不安定です。増幅バッファーを含む溶液はすべて遮光してください。
    1. 5x 濃縮増幅バッファーを高純度水で1：5の割合で希釈し、混ぜます。反応液40 µLの場合、5x 増幅バッファー8 µLを高純度水32 µLに加えます。サンプル溶液はすべて十分な量を調製してください。
    2. スライドを軽く叩いてライゲーション溶液を除去します。
    3. 1x洗浄バッファーAでスライドを室温にて5分間 × 2回洗浄します。
    4. 洗浄中に、冷凍庫からポリメラーゼを取り出し、フリーザーブロック（−20℃）を使い保管します。
    5. ポリメラーゼをステップ（a）の1x 増幅バッファーで1：80の割合で希釈し、混ぜます。
    6. スライドを軽く叩いて余分な洗浄バッファーを除去し、増幅溶液を添加します。
    7. 37℃に予熱した加湿チャンバーでスライドを100分間インキュベートします。
  6. 最終洗浄
    注記：試薬は光に不安定です。スライドは常時遮光してください。
    1. スライドを軽く叩いて増幅溶液を除去してください。
    2. 1x 洗浄バッファーBでスライドを室温にて10分間 × 2回洗浄します。
    3. 0.01x 洗浄バッファーBでスライドを1分間洗浄します。
  7. イメージングの準備
    注記：Duolink® DAPI含有In Situマウントメディウム は水性で、固化しません。透明なマニュキュアでスライドとカバーガラスの端を封します。カバーガラス内に気泡を入れないようにします。
    1. スライドの余分な洗浄バッファーを除去します。
    2. 最小量のDuolink® DAPI含有In Situマウントメディウムを用いて、スライドにカバースリップを載せます。
    3. 15分後、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡（対物レンズ20倍以上）で解析します。
    4. イメージング後、スライドは暗所にて4℃で最長4日間、または−20℃Cで最長6か月間保存します。

結果

画像取得

Duolink® PLA実験の結果は通常、使用した蛍光色素の検出に適したフィルターを装着した蛍光顕微鏡で得られます。Duolink® PLAシグナルはサンプル細胞のさまざまな位置に明確な蛍光の斑点として認められます（図1A参照）。個々のシグナルはμm以下の大きさで、複数の焦点面に現れる場合があります。その場合は、サンプルの厚み全体を画像化する必要があります。しかし、サンプル中の近接した位置で比較画像すべてを収集するのであれば、1平面だけで画像を取得しても構いません。ネガティブコントロール（例：一次抗体なしの場合、図 1B参照）で数個のシグナルが検出されることも多いのでご注意ください。ただし、10細胞当たりのシグナルが1～2を超える場合、一次抗体の最適化が必要な場合があります。

A431細胞をサイトスピンで処理しDuolink® PLAを用いてEGFRを検出した。

Figure 1.A431細胞をサイトスピンで処理しDuolink® PLAを用いてEGFRを検出した。写真はZ平面20枚を基に原画像を最大強度で投影したもの。PLAシグナルは赤色、核は青色。核の画像は1つのZ平面で取得した。A）陽性サンプル、B）一次抗体なしのネガティブコントロール。

1つの実験では、すべての画像を同じ設定（露光時間、ゲイン、使用するフィルターなど）で撮影することが重要です。ポジティブおよびネガティブコントロールを用いて設定を最適化してください。PLAシグナル数が多い場合、PLAシグナルがマージ／融合することがあります（図2参照）。この現象は高発現タンパク質が対象の場合、または画像取得中のばく露過剰によって発生することがあります。よってPLAシグナルを個別で得るには撮影の設定に注意が必要です。シグナル融合の予防やその他、実験の最適化については Duolink® PLAトラブルシューティングガイドをご参照ください。

SKBR-3高発現細胞のFFPE標本中のHer2をDuolink® PLAで検出した。

図2.SKBR-3高発現細胞のFFPE標本中のHer2をDuolink® PLAで検出した。写真はZ平面20枚をもとに原画像を最大強度で投影したもの。PLAシグナルは赤色、核は青色。核の画像は1つのZ平面で取得した。A）陽性サンプル、B）一次抗体なしのネガティブコントロール。

画像解析

PLAシグナルの定量化に使用できる画像解析ツールがいくつか市販されています。画像データの解析により、細胞内での細胞ごとまたは範囲ごとのPLAシグナルの平均蛍光強度および／または総数を得ることができます（図3）。したがって、定量値は実施した実験内の技術的および／または生物学的コントロールとの相対値の形で報告されます。しかしながら、信頼性の高い定量は、PLAシグナルの融合がなく、画像の画素数が飽和状態に達していない場合に限り可能です。

画像ソフトを用いた画像解析

図3.画像ソフトウェアを用いた画像解析。DAPI染色核（青色）は自動検出し、細胞質の大きさはユーザーが推定した（緑色枠）。対象タンパク質を示すPLAシグナルは赤色で示している。白丸のPLAシグナルおよび黄色で囲った核を解析で定量した。

トラブルシューティング

実験が上手くいくヒントやコツ、一般的なトラブルシューティング、よくある質問（FAQ）についてはDuolink® PLAトラブルシューティングガイドをご参照ください。

問題が解決しない場合やDuolink® PLA全般については、いつでもお気軽にメルクのテクニカルサポートチームまたは営業担当にご連絡ください。

カスタムサービス

Duolink® PLAアッセイは比較的簡単にタンパク質相互作用などを検出可能ですが、対象のタンパク質や実験内容によってはカスタマイズが必要な場合があります。その場合は本国のDuolink® PLA Custom Services teamがお客様のニーズにお答えします。Duolink® PLAのカスタムサービスについてはこちらをご覧ください。

関連製品
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参考文献

1.
Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200
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Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947
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Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101
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Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473
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