呼吸器疾患研究を目的とするヒトiPS細胞のin vitroにおける気道上皮肺オルガノイドへの分化

肺オルガノイドは、ヒトの肺の発生、また、ウイルス感染症（重症急性呼吸器症候群［SARS］、パンデミック（H1N1）2009［2009年の新型インフルエンザ］、中東呼吸器症候群［MERS］など）、嚢胞性線維症、ぜんそくや慢性閉塞性肺疾患（COPD）といった呼吸器疾患、また、大気汚染へのばく露や喫煙の影響の研究において有用な3次元（3D）細胞培養モデルです。従来の不死化肺細胞株や一次細胞とは異なり、肺オルガノイドでは複雑な組織構造を形成するさまざまな種類の分化細胞が見られ、より生体内の組織や機能に近いものとなっています。さらに、肺オルガノイドは少量の患者の組織または多能性幹細胞から得ることができるので、個別化医療を促進するバイオバンクづくりにも活用できます。

3dGRORヒト肺オルガノイド培養システムは、ヒト人工多能性幹細胞（ヒトiPS細胞）を、生体内の気道の分岐構造や初期の肺胞構造に似た構造をもつ成熟肺オルガノイドに効率的に分化させるための、血清を含まない多段階培養システムです。3dGRO™ヒト肺オルガノイド培養システムを用いれば、成熟した肺や気道で見つかるさまざまな種類の細胞の指標となる適切なマーカーを発現する、成熟した肺オルガノイドを多数産生することが可能です。このようなマーカーとしては、II型肺胞上皮細胞中で見られる肺サーファクタントタンパク質BおよびC（SP-BおよびSP-C)、気道の杯細胞で見られるMUC5AC、内胚葉性肺組織で見られるEpCAM、Sox9およびNkx2.1、線毛細胞のアセチル-α-チューブリン、間葉系細胞マーカーであるビメンチンなどが挙げられます。また、肺オルガノイドでは、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）を引き起こす新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）の受容体であるアンジオテンシン変換酵素II（ACE2）とともに、このウイルスの侵入を促進するセリンプロテアーゼであるTMPRSS2も発現します。

肺オルガノイド分化プロトコル

ステップ1：ヒトiPS細胞の胚体内胚葉への分化（0～4日目）

注記：細胞集密度が約70～80%で分化細胞含有率が5%未満の質の高い未分化ヒトES細胞または未分化ヒトiPS細胞（SCC271）を用いて作業を開始してください。以下のプロトコルは、6ウェル組織培養処理プレートのうち1ウェルで分化を行うためのものです。数字は1ウェルあたりの液量を示しています。作業の際には、適宜液量を調整してください。

1. シングルセル継代培地を準備します。7～10 mLのヒトES細胞またはヒトiPS細胞増殖培地（SCM130）に、最終濃度が10 µMとなるようROCK阻害薬（ROCKi）Y-27632（SCM075）を加えます。
2. 6ウェルプレートをECMゲル（CC131）でコーティングします。
3. 培地を吸引し、ウェルを2 mLのDMEM/F12または1倍PBSで洗浄します。洗浄液を吸引除去後、Accumax™溶液（A7089）1 mLをウェルに加え、37 ℃で5～6分間インキュベーションします。細胞をはがすには、プレートをしっかり手のひらに当てて軽くたたいてください。
4. （ステップ1で準備した）シングルセル継代培地1 mLをウェルに加え、5 mLピペットで1～3回上下に撹拌させながら細胞をはがします。気泡を作らないように注意してください。
5. はがれた細胞を15 mLコニカルチューブに採集した後、ウェルにシングルセル継代培地1 mLを加えて残っている細胞を回収し、同じコニカルチューブに移します。こうしてコニカルチューブ中に得られた細胞懸濁液を、140 x gで5分間遠心分離し上清を吸引します。
6. 残った細胞ペレットをシングルセル継代培地1 mL中に再懸濁し、自動細胞計数装置を用いて生細胞の総数を数えます。トリパンブルー（T8154）と血球計算盤を用いた計数も可能です。
7. ECMゲル（CC131）でコーティングした6ウェルプレートを用意し、1ウェルあたり1x10⁶個の細胞を加えます。（ステップ1で準備した）シングルセル継代培地を使用し、1ウェルあたりの総液量を3 mLとし、37 ℃で一晩インキュベーションします。
8. ウェルから培地を吸引除去し、胚体内胚葉誘導培地（SCM302）2 mLを加えたうえで、37℃で一晩インキュベーションします。
9. 2日目と3日目はステップ8を繰り返してください。4日目にフローサイトメトリー法で細胞の解析を行います。ステップ2に進む前に、80%を超える細胞が、内胚葉マーカーであるCXCR4、c-Kit、Sox-17およびFOXA2には陽性、PDGFRには陰性であることを確認します。

ステップ2：胚体内胚葉細胞の前腸内胚葉前部細胞への分化（4～8日目）

注記：4日目（胚体内胚葉細胞）に加え、前腸内胚葉前部（AFE）細胞への分化後である8日目についても高い細胞密度が観察されるはずです。以下のプロトコルでは、6ウェルプレートを使った場合の播種密度を基準として示していますが、他のウェル数のウェルプレートについては播種密度を調節してください。

1. 分化4日目の胚体内胚葉の入った6ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。
2. 各ウェルから培地を吸引除去し、それぞれ2 mLの1倍PBS（BSS-1006-B）で洗浄します。
3. 胚体内胚葉細胞をはがすためにAccumax™溶液（A7089）1 mLを各ウェルに加え、37 ºCで6～8分間インキュベーションします。
4. 5分後に目視でプレートを確認し、プレートの端を優しくたたいて細胞をさらにはがします。細胞の大半がはがれて懸濁状態になるはずです。このようにならない場合、もう2分間インキュベーションします。
5. 1ウェルあたり2 mLの1倍PBS（BSS-1006-B）を加えてAccuMax™溶液（A7089）を希釈します。細胞懸濁液は50 mLコニカルチューブ中に採集します。各ウェルに1 mLずつ1倍PBSを加えて残っている細胞を回収し、同じコニカルチューブに移します。ピペットで数回上下に撹拌させ、均一な細胞懸濁液とします。
6. 細胞懸濁液を室温で5分間、130 x gで遠心分離します。
7. 上清を吸引除去し、残った細胞ペレットを2 mLのAFE誘導用培地I（SCM305）中に再懸濁します。 自動細胞計数装置または血球計算盤を用いて細胞数を数えます。
   PBSに4 µg/mLで溶解したフィブロネクチン（F0895）溶液を用い、6ウェルプレートをコーティングします。1ウェルあたり1.5 mLの希釈フィブロネクチン溶液を加え、2～8 ℃で一晩静置します。その後、コーティング溶液を吸引除去し、ベンチフード内で蓋を外して5分間風乾させます。プレートが乾いたら蓋をして、細胞の準備ができるまでの間、静置します。
8. フィブロネクチンでコーティングされた6ウェルプレートに、1ウェルあたり10⁶個の細胞を播種し、1ウェルあたりの総液量が2 mLになるよう、各ウェルにAFE誘導用培地I（SCM305）を加えます。
9. 37 ºCのインキュベーターにプレートを入れ、優しく前後左右に振とうさせながら、確実に細胞がウェル表面に均一に分布するようにします。37 ℃で一晩インキュベーションします。
10. 5日目：ウェル中の液体をすべて入れ替え、1ウェルあたり2 mLのAFE誘導用培地II（SCM306）とします。その後、37 ℃で24時間インキュベーションします。
11. 6日目：培地をすべて入れ替え、1ウェルあたり2 mLの3dGRO™肺オルガノイド分岐用培地（SCM307）とします。 その後、37 ℃で24時間インキュベーションします。
12. 7日目：培地をすべて入れ替え、1ウェルあたり2 mLの3dGRO™肺オルガノイド分岐用培地（SCM307）とします。その後、37 ℃で24時間インキュベーションします。
13. 8日目：細胞塊や細胞凝集体が散在するコンフルエント状態の領域が形成されるという形態学的変化をAFE細胞が示しているのが正しい状態です。AFE細胞をさらに分化させて成熟肺オルガノイドを得るには、次のプロトコルに従ってください。余ったAFE細胞は、3dGRO™オルガノイド凍結用培地（SCM301）に入れ、バイアル1本当たりの細胞数を3～6 x 10⁶個としたうえで冷凍保存することができます。

ステップ3：AFE細胞の肺芽オルガノイドへの分化（8～25日目）

1. コンフルエント状態のAFE細胞層が形成されている6ウェルプレートの各ウェル中の培地を吸引除去し、1ウェルあたり1 mLの新鮮な3dGRO™肺オルガノイド分岐用培地（SCM307）を加えます。
2. 5 mLピペットを用いて、各ウェルの表面から細胞の単層を凝集塊として優しくこそぎ取ります。このとき、個々の細胞を破砕しないよう気をつけてください。6ウェルプレートの1個のウェルに入っていた細胞凝集塊を、Costar^®超低接着表面24ウェルプレート（CLS3473）の1個のウェルに移します。
3. 0.5 mLの3dGRO™肺オルガノイド分岐用培地（SCM307）を元のウェルに加え、残っている細胞をすべて回収して、細胞凝集塊の入った超低接着表面24ウェルプレートのウェルに加えます。細胞懸濁液の全液量は約1.5 mLとなります。37 ℃でインキュベーションしてください。
4. 20～25日目まで一日おきに培地を交換します。オルガノイドは浮遊状態で培養されているため、培地の交換は以下の手順に従うこと。
   1. ガラス製1 mLセロロジカルピペットを使って、浮遊オルガノイドを15 mL滅菌コニカルチューブに移し、オルガノイドがチューブの底に沈殿するまで10分間待ちます。
   2. 2 mL吸引用ピペットに真空ポンプを接続してから、内部にフィルターなどが付いていない20 µL滅菌ピペットチップを取り付け、注意深く培地を吸引除去します。このとき、オルガノイドにダメージを与えないよう、オルガノイドの上に微量の培地を残しておいてください。
   3. オルガノイドのペレットが入った15 mL滅菌コニカルチューブに0.5 mLの3dGRO™肺オルガノイド分岐用培地（SCM307）を加えます。1 mLガラス製ピペットで上下に2回撹拌した後、オルガノイドを元の超低接着表面24ウェルプレートのウェルに戻します。
   4. 15 mLコニカルチューブに0.5 mLの3dGRO™肺オルガノイド分岐用培地（SCM307）を加えて洗浄しながら、オルガノイドが残っていればすべて回収し、同じ超低接着表面24ウェルプレートのウェルに戻します。1ウェルあたりの総液量は1 mLとなります。

ステップ4：肺芽オルガノイドの成熟肺オルガノイドへの分化（25～60日目）

1. 氷上で、成長因子低減Matrigel^®マトリックス（Corningカタログ番号354230）を解凍します。
2. 組織培養処理をしていない24ウェルプレート（Corningカタログ番号351147）の中に、滅菌鉗子を用いて滅菌24ウェルインサート（Corningカタログ番号353095）を入れます。1ウェルにつきインサートは1個とします。
3. 低温の100%成長因子低減Matrigel^®マトリックスをインサート1個につき50 µLずつ分配します。Matrigel^®マトリックスが固まるまで5分間待ちます。
4. この間に、浮遊肺芽オルガノイドの入ったウェル1個の中身を60 mmシャーレに移します。また、これとは別の底がU字型の96ウェルプレートの各ウェルに、60 µLの3dGRO™肺オルガノイド成熟用培地（SCM308）を加えます。
   注記：20～25日目には、多数の肺オルガノイドが浮遊しています（図3）。各Matrigel^®サンドイッチ構造には4～6個のオルガノイドが入っているはずです。Matrigel^®中に懸濁させたオルガノイドを準備するために96ウェルプレートのウェルのうち合計何個が必要となるかを決定するため、用意する予定のMatrigel^®サンドイッチ構造の数を計算してください。
5. 滅菌されたフード付き解剖台上で、折りたたみ構造を示しているオルガノイド6個を60 mmシャーレ中から選び、10 µLにセットした滅菌20 µLピペットチップを用いて、底がU字型の96ウェルプレートの1個のウェルに移します。
6. 96ウェルプレートをフード付き解剖台から組織培養用ベンチに移動します。
   注記：Matrigel^®マトリックスがゲル化するのが早すぎないよう、一度に準備するインサートの数は3個までとすることを推奨します。
   1. ステップ5の96ウェルプレートの各ウェルに、低温の100%成長因子低減Matrigel^®マトリックスを60 µLずつ加えます。気泡ができないよう注意しながら数回ピペッティングして優しく撹拌します。1ウェルあたりの総液量は130 µLとなります。
   2. ステップ3で準備した24ウェルプレートの各インサートの中央に、オルガノイドと成長因子低減^®マトリックスの混合物（約130 µL）を直ちに加えます。
   3. Matrigel^®マトリックスが固まるまで5分間待ちます。
   4. サンドイッチ構造が6個完成できるまで、上記1～3を繰り返します。
7. Matrigel^®サンドイッチ構造を作製するため、インサート上部に低温の100%成長因子低減Matrigel^®マトリックス75 µLを加えます。24ウェルプレートを37 ℃のインキュベーター中に少なくとも30分間置いて、Matrigel^®サンドイッチ構造を確実に固めます。培地中に包埋するサンドイッチ構造が6個よりも多い場合は、ステップ4～7を繰り返してください。
8. 各インサート中と、インサートの下のウェルに、それぞれ500 µLずつ3dGRO™肺オルガノイド成熟用培地（SCM308）を加えます。
9. 一日おきに培地を交換します。
   1. 2 mL吸引用ピペットに真空ポンプを接続してから、内部にフィルターなどが付いていない20 µL滅菌ピペットチップを取り付けます。Matrigel^®サンドイッチ構造の上とインサートの下、それぞれの培地を、注意深く吸引除去します。
   2. 各インサート中と、インサートの下のウェルに、それぞれ500 µLずつ3dGRO™肺オルガノイド成熟用培地（SCM308）を加えます。

気道上皮肺オルガノイドのトラブルシューティングガイド

トラブル1：肺芽オルガノイドを分化20～25日目にMatrigel^®サンドイッチ構造に移してから2週間経っても、分岐構造や肺胞構造が見つからない。

1. 3dGRO™肺オルガノイド分岐用培地（SCM307）および3dGRO™肺オルガノイド成熟用培地（SCM308）には温度や光への感受性が高い成分が含まれています。 培地は実験計画に従って小分けにして用意しておき、冷凍や解凍を繰り返すことは避けてください。マニュアル中の「Storage and Stability（保管および安全性）」に書かれた指示に従うことが重要です。このトラブルが起きた場合には、3dGRO™肺オルガノイド分岐用培地（SCM307）や3dGRO™肺オルガノイド成熟用培地（SCM308）を新たにアリコートに小分けし、解凍して使用してください。
2. Matrigel®サンドイッチ培養には、折りたたみ構造を持つ肺芽オルガノイドを選んで使用してください。折りたたみ構造を持つ肺芽オルガノイドの例については、図3をご覧ください。
3. 浮遊懸濁培養を始める前に、分化4日目および8日目の両方で高い細胞密度が確認されるはずです。細胞の種類によって、播種密度を調整してください。

トラブル2：浮遊肺芽オルガノイドが懸濁培養の途中でプレートの底に接着してしまう。

組織培養処理済みの24ウェルプレートやシャーレではなく、超低接着表面24ウェルプレートを使ってください。

トラブル3： Matrigel^®サンドイッチ培養のために培地を交換した後に、一番上の層が柔らかいように見える、または崩れてしまう。

サンドイッチの一番上の層に加える100%成長因子低減Matrigel^®マトリックスの量を50 µLではなく75 µLにしてみてください。24ウェルプレートをインキュベーターに入れる時間を30分以上とし、Matrigel®サンドイッチ構造が確実に固まるようにします。

トラブル4： c-kit⁺やCXCR4⁺に陽性の細胞の割合が、4日目に80%を切っている。

c-kit⁺やCXCR4⁺に陽性を示す細胞が密集した集団が4日目には見られるはずであり、そのうち80～90%またはそれ以上の細胞がこれらに陽性を示すはずです。4日目の時点で胚体内胚葉の誘導が成功していない場合に分化を継続させることは推奨されません。質の高い未分化ヒトiPS細胞を使って初めからやり直してください。

トラブル5： 成熟過程の後半で、培地が急速に黄色くなってしまう。

この時期の包埋オルガノイドは大きさが増し、一部は複雑な突起を延伸させることもあります（図5）。3dGRO™肺オルガノイド成熟用培地（SCM308）をインサートの上に750 µL、インサートの下のウェルに500 µL、それぞれ加えてください。