組換えタンパク質の超高感度検出を可能にする3xFLAG^®システム発現ベクター

3xFLAG^®システムは、3つのタンデムFLAG^®エピトープを合計22個のアミノ酸に融合させた改良システムです（図1）。3xFLAG^®を含む融合タンパク質の検出感度は、他のシステムを最大で200倍上回ります。従来のFLAGタグと同様に、3xFLAG^®は親水性で、エンテロキナーゼ切断部位を有し、比較的小さいため、タンパク質機能の変化、他のエピトープタグのブロック、溶解性の低下等の可能性が最小限に抑えられています。発現量が低い場合は、3xFLAG^®が最適です。メルクで提供しているCMVベクターにより、3xFLAG^®融合タンパク質の一過性発現または安定発現の選択が可能です。

• 超高感度システム - ANTI-FLAG^®抗体を使用して10フェムトモル未満を検出（図2）。哺乳類細胞における発現レベルが低い場合に最適。
• 優れた検出感度 - 他のシステムの20～200倍（図3）。
• 多用途 - 免疫沈降、ウエスタンブロット、免疫細胞化学による検出の強化。
• 検出および精製製品の幅広い選択肢 - ANTI-FLAG抗体、レジン、アフィニティキャプチャプレート。

図1. 3xFLAG®配列。エンテロキナーゼを使用すると、タグのC末端にあるAsp-Asp-Asp-Asp-Lysアミノ酸配列の下流で切断することにより、N-末端3xFLAG®タグの除去が可能となります

図2. ウエスタンブロッティングで従来のFLAGと3xFLAG®を比較。ウエスタンブロッティングを用い、精製された3xFLAG®-BAP（細菌性アルカリホスファターゼ）とFLAG®-BAPをニトロセルロースメンブレンに転写しました。検出は、ANTI-FLAG® M2モノクローナル一次抗体、抗マウス-HRP二次抗体、およびECL™化学発光基質を使用して行いました。

 

図3. 3xFLAG®の相対感度。各タンパク質融合タグは、GSTのC末端に個別にクローニングされました。精製したタンパク質を1マイクログラムから0.01ナノグラムに希釈し、分析しました。各タグの検出限界は、それぞれの一次抗体と二次抗マウスIgG-HRPコンジュゲートの推奨希釈液を使用したウエスタンブロット解析によって測定されました。ブロットはECLを使用して作成されました。

 

CMVベクターの機能

弊社の哺乳類発現ベクターには、哺乳類細胞での高レベルの構成的発現を誘発する強力なCMVプロモーターが含まれています。強力なヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター調節領域は、COS細胞において1 mG/Lという高い構成タンパク質発現レベルを惹起します。効力の低い細胞株の場合、タンパク質レベルは通常約0.1 mG/Lです。SV40複製起点の存在により、SV40複製許容COS細胞で高レベルのDNA複製につながるでしょう。プレプロトリプシン（PPT）リーダー配列を含むベクターは、ANTI-FLAG抗体、レジン、およびプレートを使用して精製するために、FLAG融合タンパク質を培地に直接分泌します。

一過性発現ベクター

• N末端融合
• 細胞質発現
• 分泌のためのPPTリーダー配列
• デュアルタグ構成
• エンテロキナーゼにより 3xFLAG^® タグ除去
• 細菌細胞における複製のpMB1（pBR322の誘導体）起点
• 細菌におけるアンピシリン耐性選択のためのβラクタマーゼ遺伝子

 

図4. MCS領域

安定発現ベクター

• ネオマイシン選択による安定発現（G 418硫酸塩）
• NまたはC末端融合
• デュアルタグ構成
• 細胞質の発現または分泌
• エンテロキナーゼにより N末端3xFLAG^® タグ除去
• 細菌細胞における複製のpMB1（pBR322の誘導体）起点
• 細菌におけるアンピシリン耐性選択のためのβラクタマーゼ遺伝子

図5. 安定発現ベクター

BICEP™安定発現ベクター

• 優れた安定発現
• Neo^r遺伝子は、EMCV IRESの制御下でキャップ非依存的に翻訳されます
• プラスミド喪失の懸念がない安定発現株の作製
• 他社製品を30倍以上上回る発現レベル
• 継代を何度も重ねた後も高い発現レベルを維持します

図6. BICEP安定発現ベクター