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MISSION™ siRNA　よくあるお問い合わせ（FAQ）

siRNA（低分子干渉RNA）は、mRNAを切断するためにRISC（RNA誘導型サイレンシング複合体）を誘導することによって遺伝子発現をサイレンシングする短鎖の二本鎖RNAです。

一般的な21mer duplexの場合、約13,300です。実際の分子量は、標準分析証明書／テクニカルデータシートに記載されています。

短期保管の場合、一本鎖RNAオリゴヌクレオチドはTEバッファー中で－80℃で保存してください。長期保管の場合は、－80℃でエタノール沈殿させて保管するのが最適です。RNaseへのばく露を最小限に抑える予防策を講じることで、有効期間が長くなります。

－80℃の冷凍庫を使用できない場合は、－20℃での保管でもほぼ問題ありません。再懸濁した場合は、小分けにして保管してください。凍結と解凍の繰り返しや、「霜取り機能付き」冷凍庫での保管は推奨されません。

私たちのR&Dチームは、複数のsiRNA duplexで安定性試験を実施しました。－20℃で3年間保管した乾燥状態のsiRNA duplexは安定性を示しました。室温で保管した乾燥状態のsiRNA duplexは、2年後にごくわずかな分解の兆候のみを示しました。いくつかの配列特異的な安定性差異の試験を実施しましたが、2年目の時点で分解の兆候を示したのは一部の配列のみでした。これを示したのは二本鎖siRNAのみです。

凍結と解凍の繰り返しや、「霜取り機能付き」冷凍庫での保管は推奨されません。siRNAは、－20℃で最大6カ月保存できます。霜取り機能のない冷凍庫の場合、溶液の凍結と解凍は3～5回以内を推奨しています。凍結乾燥の形態では、－20℃の場合よりも長期間duplexが安定します。

脱塩を行えば、ほとんどのニーズに十分応えられます。分離鎖の二重化は、自己相補鎖間の完全な一致に依存するため、このプロセスが全長オリゴヌクレオチドに対して自己選択されます。

製造拠点によっては、さらなる品質確認のため、duplexを未変性のPAGEゲルで泳動することがあります。

バリデーション済みのTuschlプロトコルを用います。アニーリングでは、20 μM一本鎖21塩基RNAをアニーリングバッファー（100 mM酢酸カリウム、pH 7.4の30 mM HEPES-KOH、2 mM酢酸マグネシウム）中において90℃で1分間、その後37℃で1時間インキュベーションします。高濃度のsiRNAが必要な場合は、20 μMを超えるRNAをそれぞれ使用します。

複数の理由が考えられます。

  1. サンプルが均質でない可能性があります。
  2. 装置の違いにより、見かけ上の値に差が生じた可能性があります。デュアルビームUV-Vis分光光度計の使用を推奨しています。
  3. サンプルの濃度が高すぎる可能性があります。吸光度値は、0.15～0.6の範囲の標準曲線の線形領域内が最も高精度です。
  4. サンプルを希釈しすぎた可能性があります。少量（1～1.5 μL）の希釈液での測定は、ばらつきが生じる可能性があります。

はい。サンプルは乾燥状態で発送され、室温で2～4週間は安定的です。siRNAを受け取ったら－20℃（－80℃がより望ましい）で保管するよう推奨しています。

はい。5'または3’修飾に対応可能です。

はい。対応可能です。

一般的な選択肢を以下に示します。

  • アミノ修飾因子C6、アミノ修飾因子C7：これらの修飾は、単鎖RNAの一方または両方の末端をブロックするためか（センス鎖の5’末端でアミンを用いるとRISCへのアンチセンス鎖の好ましいローディングが促進されます）、またはNHSエステル色素を付着するためのいずれかに使用されます。NHSエステル色素は、ホスホロアミダイトとして使用できない可能性があるか（合成中にいずれかの単鎖RNAに直接添加）、またはRNAの切断と脱保護の化学反応に適合しない可能性があります。
  •  ビオチン：一般に、ストレプトアビジンでタグ付けされた分子を付着するため、またはsiRNAを他の分子から分離するために使用されます。
  • Thiol-Modifier C6 S-S：アミンと同様に、ジスルフィド結合によって他の分子を付着させるために使用できます。
  • Cyanine 3、5、および5.5：蛍光によっていずれかの単鎖RNAを検出するために使用されます。これは、トランスフェクション効率の可視化や測定に役立ちます。
  • 6-FAM™：蛍光によっていずれかの単鎖RNAを検出するために使用されます。これは、トランスフェクション効率の可視化や測定に役立ちます。
  • リン酸：アミン修飾と同様に、鎖選択プロセスに役立つ可能性があります。
  • 2'-OMe RNA：細胞ヌクレアーゼ分解に耐性を示し、特異性を強化します。
  • ホスホロチオエート：細胞ヌクレアーゼ分解に耐性を示します。
  • コレステロール：原形質膜の透過性を改善します。

上記オプションに関する詳細については、修飾のページをご覧ください。

はい。カスタムsiRNAとして注文できます。

なし

dTdTオーバーハングを使用しています。2001年のElbashirらの論文*には、「細胞培養培地中およびトランスフェクト細胞内のsiRNAのヌクレアーゼ耐性を強化できるため、チミジンオーバーハングが選択されました。」と記載されています。

RNAi研究の初期の頃に、この分野の先駆者がdTdTオーバーハングを選択しました。これは歴史上重要な選択といえます。siRNA設計にはdTdTオーバーハングがよく使用されますが、UUまたはUGオーバーハングも一般的です。2001年以降のElbashirらの複数の論文には、遺伝子数と系統数の制限に基づいたsiRNA設計のための一連の規則が記載されていますが、研究者はdTdTおよびUUオーバーハングを使用し続けています。

*Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K & Tuschl T (2001).Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture.Nature, 411, 494-498.

Rosetta siRNA設計アルゴリズムは、位置特異的スコアメトリクス（PSSM）と極めて重要なsiRNAシードリージョンの知識を使用して、目的のターゲット遺伝子に対して最も効果的で特異的なsiRNAシーケンスを予測します。さらに、Rosetta siRNA設計アルゴリズムは、3年を超える遺伝子サイレンシング実験のフィードバックによって鍛えられてきたため、アルゴリズムのin-silico規則は実環境の経験的証拠によって方向付けされ強化されています。

いいえ。安定したノックダウン細胞株が必要な場合は、shRNA製品ラインをご覧ください。

siRNAから得られる遺伝子サイレンシングは、早ければトランスフェクション後24時間で評価できます。効果は、ほとんどの場合に5～7日間持続します。ただし、ノックダウンの期間とレベルは、細胞のタイプとsiRNAの濃度によって異なります。サイレンシングを持続させるためにトランスフェクションを繰り返すことができます。

siRNA実験にenoxacinを追加することにより、siRNAのターゲット遺伝子サイレンシング能力が強化されることが示されています。詳細については以下の論文をご参照ください。

Shan G, Li Y, Zhang J, Li W, Szulwach KE, Duan R, Faghihi MA, Khalil AM, Lu L, Paroo Z, Chan AW, Shi Z, Liu Q, Wahlestedt C, He C & Jin P (2008).A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing.Nat Biotechnol, 26, 933-940.

以下の参考文献もご覧ください。

Duxbury MS, Ashley SW & Whang EE.(2005).RNA interference: A mammalian SID-1 homologue enhances siRNA uptake and gene silencing efficacy in human cells.Biochem Biophys Res Commun, 33, 459-63.

はい。duplex 5 nmol 4本分を1本のチューブ（20 nmolのプール）にしたものと、各duplexを1チューブあたり5 nmolずつにしたもの4本（合計20nmol）を1セットとした納品形態で、カスタムまたはプレデザインsiRNAを選択できます。しかし、私たちが開発した高度な液体取扱装置は、上記以外の幅広い納品方法を可能にします。

さらに、別の製品オプションにesiRNAがあります。これは、E. coli RNase IIIによる長鎖dsRNA（二本鎖RNA）の切断によって生じたsiRNAで構成されています。esiRNAは、すべてが同じmRNAをターゲットとするsiRNAのプールで、高度な特異性をもっています。

はい。プールされる各duplexについて、その半量を取り出してから以下の手順に従ってください。

  1. 100 μLの分子生物学グレード水（W4502）で、各duplexを再懸濁します。乾燥siRNA材料に含まれた状態のため、バッファーは必要ありません。
  2.  各siRNAから50 μLを取り出して、新しいチューブに移します。
  3. 各チューブに残ったsiRNA溶液は、別の試験に使用できます。

50～100 μMの濃度を推奨しています。

1X TE中での乾燥siRNAの再懸濁は推奨されません。

siRNAを再懸濁する前に、チューブを軽く遠心分離してください。siRNAはバッファーの存在下でドライダウンします（以下を参照）。そのため、siRNAは分子生物学グレード水（DNaseおよびRNaseフリー）（W4502）中で再懸濁する必要があります。

siRNAバッファー：

  •  酢酸カリウム（100 mM）
  • HEPES（30 mM）
  • 酢酸マグネシウム（2 mM）

注記：siRNAは、取り扱い中に混入したヌクレアーゼによって分解します。RNaseフリーの試薬、チューブ、およびフィルター付／バリアピペットチップを使用してください。siRNAを取り扱う際は必ず手袋を着用してください。

この技術資料を参照してください。

以下の式にしたがってください。

nmol to ug formula

siRNAは以下のdsRNAに相当します。

  • 1A260ユニット= 60 μg dsRNA

したがって、

  •  1 OD siRNA = 5 nmol = 60 μg

下表を参照してください（注記：最終siRNA濃度= 30 nM、1 nmol = 1000 pmol）。

小規模のパイロット実験でsiRNAを試験し、5～100 nMの範囲の濃度を培養培地中で使用して各細胞タイプと新しい実験手順に最適な濃度をバリデーションすることを推奨しています。開始濃度は一般に30 nMが妥当であるといわれています。望ましいノックダウンが得られる最小限の濃度を使用する必要があります。これにより、オフターゲット効果を低減できます。

過剰発現した遺伝子は、siRNAを使用して正常にサイレンシングされることが示されています。過剰発現がどの程度抑えられるかを予測することは困難です。効果的なノックダウンのために、最終siRNA濃度と毒性／細胞自然免疫の問題とのバランスをとる必要があるかもしれません。

一般的な参照遺伝子のGAPDHやサイクロフィリンBなどの安定した遺伝子でも、標準的なsiRNAの手法を使用して効果的にサイレンシングできます。細胞生存率の解析が実施され、常にコントロールされていることが望ましいですが、遺伝子発現が最も安定していることが多い必須遺伝子の候補のサイレンシングが求められる場合には、細胞生存率はさらに重要になります。

プレデザインsiRNAは、高発現で安定したmRNAのサイレンシングに効果的であることが示されています。遺伝子のタンパク質が非常に安定している可能性がある場合でも、siRNAを使用すればmRNAの安定性は重要な検討項目ではありません。RNAiは、mRNAを直接切断のターゲットとし、細胞のヌクレアーゼによって切断および分解します。正しい判断が行えるように、目的のmRNAに応じて必ずsiRNAの適正量を最適化してください。

個々のsiRNAを自身でプールするのではなく、プールされたsiRNAをご希望の場合は、プールの中に含まれるsiRNAを個別に注文し、実験で個別にテストする方法が最適です。プーリングと試験に適した濃度の個別のsiRNAを販売しています。

私たちは、浮遊細胞に適したトランスフェクション試薬を提供していません。有効な試薬が数種類あり、他のメーカーから入手できます。

トランスフェクションのためのプロトコルは1つだけではありません。プロトコルは使用するトランスフェクション試薬によって異なります。以下の2種類の試薬を提供しています。

いずれのトランスフェクション試薬にも、その製品注文ページにプロトコルを含む製品情報の記載があります。

細胞株に最適なトランスフェクション条件を特定するには、細胞密度とsiRNA濃度のマトリックスの構築が推奨されます。バリデーション済みで高効率のsiRNAを最適化のために用いることをお勧めします。細胞株に対して適切であれば、血清ありと血清なしのマトリックスもテストする必要があります。

多くの場合、細胞株は求められる研究の機能として選択されます。たとえば、肝機能に主眼を置く研究の場合は、肝細胞に由来するHepG2またはこれと同等の細胞株がよく使用されます。

ライフサイエンス研究には、HeLaおよびA549細胞株が一般に使用されているため、私たちのほとんどの試験はこれら2種類の細胞株で実施されています。

ポジティブコントロールとしては、ポジティブコントロールsiRNAを提供しています。ネガティブコントロールには、MISSION™ siRNA Universalネガティブコントロールが推奨されます。

私たちは、カスタムのポジティブまたはネガティブコントロールの合成にも対応します。多くの研究者は、独自のスクランブル配列を持っています。また、luciferaseやeGFP siRNAコントロールを使用する研究者もいます。これらは、カスタムsiRNAと同様に注文できます。

luciferase（または他のマーカー遺伝子）の利点は、該当するマーカー遺伝子とともに同時トランスフェクションする際に、これらのsiRNAをポジティブコントロールとしても使用できることです。

オフターゲット識別的遺伝子発現が原因で、RNAi実験から高品質のデータを得ることが困難なことがあります。この問題の解決法に関する明解な回答はありません。ノックダウン実験のためのesiRNAを提供しています。この製品は、オフターゲット効果を低減しながら効果的なノックダウンをもたらします。 esiRNAは、個別の設計と低濃度を使用できることにより、これを実現しています。

siRNAは遺伝子の3’ UTRを認識してこれに結合するため、miRNA（microRNA）と同じようにふるまう可能性があり、意図しないオフターゲットサイレンシングを招くおそれがあります。哺乳類mRNAの3分の1は、平均して1つ以上のmiRNAのターゲットです。そのため、siRNAがmiRNAの経路に入ると、重大なオフターゲットサイレンシング効果を引き起こすおそれがあります。

はい。私たちはPerkinElmer®（Bioo Scientific™）と協力して、MISSION™ in-vivo品質siRNAを、Bioo Scientific™のMaxSuppressor™ In Vivo RNA-LANCEr II in vivo導入試薬でバリデーションしています。特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。

はい。私たちは、MISSION™ in-vivo品質のsiRNAを提供しています。この製品は、動物向けのiScale（中間規模）の量（mgおよびg）だけでなく、よりスケールの大きい研究に使用できます。

MISSION™ in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。

選択する導入試薬によって異なる場合があります。プロトコルについてはメーカーの技術告示をご覧ください。

MISSION™ in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。

in vivo研究のための実験セットアップの概要をまとめる必要があります。これには、モデル生物の選択、導入経路、導入試薬の使用の有無、用量および投薬の頻度などが含まれます。導入される濃度は、ターゲットの性質、発現パターンおよび試験の規模に大きく左右されます。

MISSION™ in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。

MISSION™ in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。MISSION™ in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。

MISSION™ in-vivo品質siRNAのランディングページをご覧ください。また、特定の導入試薬を見つけるには、PubMedを閲覧して類似した研究を確認してください。

バリデーションには以下の2つの項目があります。

  • Rosettaアルゴリズムを用いて、すべてのプレデザインsiRNAをin silicoでバリデーションします。
  • プレデザインsiRNAのサブセットを、概要に従って機能的にバリデーションします。
       
    • トランスフェクション試薬：さまざまなトランスフェクション試薬を用いて、siRNAコンストラクトを機能的にバリデーションします。
    • siRNA濃度：さまざまな濃度を使用します。50 nMが最も一般的で、60%を超えるバリデーション作業に使用されます。50 nMが主に使用される理由は、Rosettaアルゴリズムをバリデーションするために使用した濃度だからです。続いて、さらに低い濃度で性能を確認します。
    • 細胞株：ほとんどすべてのバリデーション試験は、HeLa細胞で実施されます。
    • 納品形態：96ウェルプレート
    • 繰り返し試験：バリデーション対象の各siRNAについて、少なくとも3回の生物学的試験と3回の技術的試験を実施します。さらに、ほぼすべてのバリデーション実験では生存率試験が実施されます。
    • mRNAを採取するまでの時間：ほとんどの測定値は、トランスフェクション後24時間の時点で取得されます。
    • ノックダウンの検出：分岐DNA法またはqPCR

1ターゲット遺伝子につき3つのプレデザインsiRNA中2つが75%以上のmRNAレベルでのノックダウン効率を示すことを保証します。カスタム設計siRNAは保証の対象外です。全保証内容をご確認ください。  

新しい実験を開始する際は、上位3つのプレデザインsiRNAを選択するよう推奨しています。

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