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RNA免疫沈降法(RIP)FAQ

1.RNA免疫沈降法で架橋処理を行う場合、どのようにすればRNAの品質を最大限に高めることができますか?

ホルムアルデヒドは、DNAやRNAの品質を損なう可能性があるため、RNAをあまり損傷させずにRNA-タンパク質複合体を安定化できるような架橋時間に最適化する必要があります。架橋時間は2分~30分までの範囲で設定してください。また、架橋反転時間も非常に重要で、その範囲は45分~4時間までと考えられます。

2.RNA免疫沈降法で非特異的結合を低減するにはどのようにすればよいですか?

ビーズが予めBSAでブロックされていない場合には、酵母RNAまたは1% BSAを含むブロッキング液でブロックを試みることができます。 Magna Nuclear RIP™(Native)RIPキット(製品番号:17-10522)やMagna Nuclear RIP™(Cross-Linked)(製品番号:17-10520)でも、非特異的結合を大きく低減して、シグナル/ノイズ比を上げることができます。

3.RNA免疫沈降法では、どのような場合に架橋処理をすべきですか?

目的タンパク質とRNAの相互作用が直接的かどうかわからないときには、架橋処理をお勧めします。タンパク質結合を検出できるかどうかは実験条件にもよりますので、まずはお客様のIP条件下でタンパク質-RNA相互作用が確実に維持されるよう、架橋処理を行うことをお勧めします。お客様のIP条件下でタンパク質-RNA相互作用が確認できた後に、ネイティブIPをお試しください。

4.RNA免疫沈降法(RIP)で、サンプルよりもネガティブコントロールから得られるトータルRNAが多くなることは問題ですか?

これは、お客様のRIPが特異的であることを示す良い指標と考えられます。サンプルよりもネガティブコントロールからのRNA回収率が高くなる(5~10倍)ことは珍しくありません。大切なことは、トータルRNA中のどのくらいの割合がお客様にとって意味を持つものかという点です。すなわち、お客様のネガティブコントロールには意味を持たない多種のRNAが大量に含まれている可能性もあれば、IPには特異的かつ重要なものが濃縮されている可能性もあります。

5.RIP RNAを用いてqPCR解析を実施するとき、RIP/Inputの比率はどのように決めればよいですか?Ct値を使用する必要がありますか、それともいくつかの遺伝子に対してキャリブレーションを行う必要がありますか?

まず、テンプレートDNA(またはcDNA)の段階希釈液を用いて標準曲線を作成してください。次に、作成した標準曲線を用いてinputおよびRIPサンプルについて相対値を算出し、比率を計算します。

RIP実験ガイド、トラブルシューティングのヒントおよび補足プロトコルの詳細については、RNA免疫沈降法(RIP)のページをご覧ください。

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