COVID-19ワクチンの短期間での開発と成功は、mRNAの力を証明しています。しかし、その可能性はワクチンの用途だけにとどまりません：mRNA技術 は、アンメットメディカルニーズへの取り組みにおいて非常に大きな将来性があり、がん、心臓病、感染症との闘いに新たな治療オプションをもたらします。
患者由来細胞の細胞質にmRNAを導入すると、標的タンパク質の産生が誘導されます。産生されたタンパク質は、治療薬または予防薬として作用したり、ワクチン接種の目的である免疫応答を引き起こす抗原として機能したり、欠陥のあるタンパク質の代替として機能したり、抗腫瘍反応を活性化したりすることができます。
ワクチンや遺伝子治療に広く使われているアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターのようなウイルスデリバリーシステムとは対照的に、mRNA技術などのウイルスを使用しない非ウイルス性デリバリーシステムには、優れた安全性プロファイル、高い汎用性、テンプレート化されたプロセスによる製造の簡素化といった複数の利点があります。開発に関わるサイエンティストは、プロセスやデリバリープラットフォームの最適化により、mRNAの安定性、翻訳、安全性を向上させることに専念しています。
mRNA開発製造用のメルクの全ての製品とサービスをご覧ください。
セクションの概要
mRNA製造に関する考慮事項
mRNAワクチン・mRNA治療薬 の開発と製造は、比較的シンプルで拡張性があり、極めて迅速に行うことができます（図1）。mRNA技術は、開発から臨床試験および承認までの期間を短縮できるため、感染症の大流行への迅速かつ効果的な対策としてのみならず、アンメットニーズのある疾患の新規治療法の開発にとっても魅力的です。
mRNAは、酵素プロセスを介したin-vitro 合成により作られます。従来のin-vivoタンパク質発現とは対照的に、時間のかかるクローニングや増幅のステップ、そして細胞や宿主細胞タンパク質の除去が不要です。この簡略化された製造工程では、どの標的でも同じ反応材料とリアクターを使用できるため、GMP施設は非常に短い期間で工程と製剤化への適応を最小限にしながら新たな標的タンパク質に切り替えることができるため、驚くべきスピードと柔軟性が発揮されます。
図1.一般的なmRNA製造工程の概要
最終製品の工程、収率、品質、安全性を最適化するために検討すべきいくつかの重要なポイントがあります。例えば、最適なプロセス化学物質と原材料の選択などがあります。特に、in-vitro 転写とダウンストリーム精製では、mRNAは、酵素分解の高いリスクから守られていません。ヌクレアーゼ活性がないことが検証済みの製品を使用することで、mRNAの産生、精製、製剤化までの工程全体で、RNaseによる分解のリスクを最小限に抑えることができます。微生物やエンドトキシンによる汚染のリスクを制御するためには、微生物やエンドトキシンが規定されている低いレベルである製品を使用することも重要です。これは微生物汚染により害を及ぼす可能性が高まるため、注射剤などのハイリスクのアプリケーションでは特に非常に重要です。
このウェブページは、mRNAに特化しており、技術や製品の選択に関する詳細情報を提供し、mRNA の製造から最終充填までのプロセスをナビゲートします。お客様に情報に基づく決定を下していただけるように、製品、サービス、専門知識に関する詳細情報は、以下のカタログに記載しています：「Enabling Capabilities and Solutions for all mRNA platforms」、「Process chemicals for mRNA drug manufacturing」。
図2.mRNAの構造
- 5'末端配列のキャップ領域：mRNAの成熟、効率的なタンパク質翻訳のためのリボソームによる認識、安定性向上のためのヌクレアーゼ消化からの保護に必須です。
- mRNAコード領域の上流と下流のドメインにある非翻訳領域（UTR）：mRNAの翻訳、局在化、安定性の制御は、タンパク質発現効率を向上させるために利用できます。
- 翻訳領域またはコード配列領域：目的の遺伝子（GOI）を含みます。
- Poly(A)：3'エキソヌクレアーゼによる消化を防ぐことで、タンパク質の翻訳とmRNAの安定性にとって極めて重要になっています。
mRNAの作製：
mRNAベースの治療薬やワクチンの生産 は、図1に示すように、プラスミドDNA（pDNA）鋳型から始まり、続いてそれが直鎖化されてRNAに転写されます：
- pDNAの作製：鋳型pDNAには、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターおよびそれに対応するmRNAコンストラクトに対応する配列が含まれています。pDNAコンストラクトの中心的役割を考えると、その設計と純度は、mRNA製品を最適化するために重要な要素です。必要なpDNAは、微生物細胞（通常はE. coli）内で増幅されます。その後、精製ステップを経て、高純度で濃縮された環状pDNAが得られます。核酸サイズ、高い粘度、せん断に対する繊細さ、pDNAと不純物との類似性などに関連する課題を克服する戦略については、メルクのガイド「Designing a Plasmid DNA Downstream Purification Process」で詳しく取り上げています。
- pDNAの直線化：環状pDNAは、反応バッファー1中で制限酵素により直線になり、目的のmRNAを転写するRNAポリメラーゼの鋳型となります。直鎖化は、転写時の読み飛ばし（リードスルー）を回避するために必要です。読み飛ばしが起こると、非標的mRNAが生成され、除去が必要な不純物が増加する可能性があります。
- pDNAの精製：制限酵素、ウシ血清アルブミン（BSA）、DNA断片、エンドトキシンなどの不純物が除去されます。ラボスケールプロセスの多くでは、溶媒抽出法が使用されていますが、溶媒抽出法はGMP製造環境に適していません。この精製ステップでは、代わりに、タンジェンシャルフローフィルトレーション（TFF）およびクロマトグラフィーを用いて不純物を効率的に除去できます。エンドトキシンは、pDNA製造工程から生じる重要な不純物として同定されており、後続の工程、そして最終的には患者の安全性に大きな影響を及ぼします。エンドトキシンは、界面活性剤を用いて除去できます。例えばDeviron® C16界面活性剤 は、従来の界面活性剤に代わる、REACH準拠の持続可能な生分解性代替品として適しています。2
pDNAの作製および精製 の詳細については、メルクの専門技術資料をご覧ください。
- In-vitro 転写（IVT）：鋳型DNAである直鎖化されたpDNAは、天然の転写プロセスの要素を用いて酵素反応によりmRNAへと転写されます。in-vitro 転写における重要な構成要素は、DNA配列をRNA配列へと転写するためのRNAポリメラーゼ、mRNAのビルディングブロックとしてのヌクレオシド三リン酸（NTP）、mRNAの収量を向上させるための無機ピロホスファターゼ（IPP）、およびRNA分解を予防するためのRNase阻害剤です。転写バッファーには、通常、ジチオスレイトール（DTT、RNase活性を阻害することで、mRNAの安定性をサポートするジスルフィド結合還元剤）やスペルミジン（転写効率と核酸安定性を向上させる成分）などの化学物質が含まれています。
- 強力な分析ツールであるラマンは、IVTステップなどの酵素反応をモニタリングするのに使える可能性があります。これまで、IVTステップのモニタリングのために、面倒なオフライン分析が実施されていますが、これでは反応条件や生産性目標が達成されていない場合に即座に対応することができません。この問題は、ラマン分光法で解決できるかもしれません。この分析法では、CPPやCQAをかなり短時間で測定できるため、最適なプロセス条件の確保のためにユーザーはより迅速に決定を下すことができます。
- キャップ付加：転写後の最終的なmRNA構造は、その安定性および細胞への効率的な導入のため、5’キャップ構造を必要とします。キャップは、共転写による付加ならびに2段階酵素プロセスによる付加という2種類の方法で付加できます。
- 共転写によるキャップ付加では、通常、キャップアナログおよびグアノシン三リン酸（GTP）を4：1の比率で混合した転写ミックスを使用します。共転写によるキャップ付加は、IVTステップの間に同じ反応混合液中で行うことができるため、酵素によるキャップ付加と比較すると低コストで迅速です。しかし、効率と収量は低く、結合ミスや逆方向の付加によってキャップが付加されていない不純物が生成されることがあります。5’キャップが逆方向に付加されることを阻止し、翻訳効率を向上させることを目的として、Anti-Reverse Cap Analog（ARCA）が開発されています。
- 酵素によるキャップ付加（翻訳後キャップ付加）は、in-vitro 転写混合物からmRNAを精製した後に行われます。この反応では通常、ワクシニアウイルス由来のキャップ付加酵素を用いて、mRNA構造にキャップ構造を付加します。酵素によるキャップ付加は、キャップ付加効率が極めて高いですが、共転写によるキャップ付加よりも高コストであり、より多くの単位操作を必要とします。
以上のステップの後に、mRNAの精製と製剤化が行われ、最終製剤が得られます。
mRNAの精製
in vitro 転写ステップ後、不純物およびエンドトキシン、免疫原性のある二本鎖 RNA（dsRNA）、残存する鋳型DNA、RNA ポリメラーゼ、元素不純物などを含有する前工程で使用した材料からmRNAを精製します。この段階では、mRNAは、TFF、酵素によるキャップ付加、および／またはクロマトグラフィーステップに適したバッファーに溶解されている必要があります。 mRNAの精製および残留DNAの除去にはいくつかの選択肢があります：
- タンジェンシャルフローフィルトレーション（TFF） は、膜に保持されない小さな不純物からmRNAを効率的に分離するために使用されます。通常、鋳型DNAは、DNaseの添加によって分解されます。その結果得られる小さなDNA断片は、TFFを用いて大きなmRNA分子から容易に分離できます。mRNA のサイズに基づいて、30～300 kDaの分子量カットオフを使用することができます。TFFを使用すると、同じ操作で対象物質の精製、濃縮およびダイアフィルトレーションが可能です。しかし、小さなDNA断片がmRNAとハイブリダイズして、新たな不純物を生成する可能性があり、これは鋳型DNAを除去するキャプチャーを使用すれば回避できます。3
- クロマトグラフィー技術、例えば逆相イオン対（IPRP）クロマトグラフィー、 陰イオン交換（AEX）クロマトグラフィー、poly(dT)をキャプチャー用分子として用いるアフィニティークロマトグラフィー（AC）など（図3）は、鋳型DNAを効率的に除去する手段を提供することで、鋳型DNA消化の必要性や、限外ろ過／ダイアフィルトレーションのステップでハイブリダイゼーションが発生するリスクを排除します。1 クロマトグラフィーは、酵素によるキャップ付加のステップ後にも、不要な生成物やオリゴヌクレオチド不純物を除去するために使用されます。しかし、クロマトグラフィーは高コストであり、メディア（充填剤）交換や後続ステップの前処理として、やはりTFFが必要となります。
図3.逆相イオン対クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによるmRNA精製の比較（DBC：動的結合容量）4,5
- 逆相イオン対クロマトグラフィー（IPRP） は、一般に小規模生産に使用されます。この手法は、極めて効率的かつ迅速にRNAを精製でき、DNA、二本鎖RNA（dsRNA）および短い転写産物から一本鎖RNA（ssRNA）を良好に分離できます。この方法の欠点としては、溶媒を使用するためGMP製造設備での生産に向いていないこと、イオン対試薬によりmRNAとの複合体が形成されるためその除去にダイアフィルトレーションが必要となること、タンパク質や凝集体によるファウリングが生じやすいためキャプチャーよりポリッシングに向いていること、などが挙げられます。
- 陰イオン交換クロマトグラフィー（AEX）は、動的結合容量が大きく（10 mg RNA/mL以上）、免疫原性のある不純物（dsRNA、キャップ付加されていないRNA、RNA-DNAハイブリッド、その他のヘアピンmRNAなどのRNA構造など）を極めて高い効率で除去できます。AEXでは水溶液を使用できますが、レジンに結合した高分子量のmRNAを脱着させるために、毒性を発揮する可能性のあるカオトロピック剤の使用や最高85°Cまでの昇温が必要となる場合があります。常温で溶出するのは通常、500塩基未満のmRNAです。5
- アフィニティークロマトグラフィー（AC） poly (dT)をキャプチャー用分子として用いるアフィニティークロマトグラフィーには、完全長mRNA転写産物のポリ (A) 鎖を特異的にキャプチャーするレジンを使用します。このプロセスにより、DNA、ヌクレオチド、酵素、バッファー成分およびポリ(A) 鎖を持たないその他のあらゆる不純物が効率的に除去されます。AEXと同様、水溶液を使用することができ、ACの場合、一般に塩濃度勾配が使用されます。IPRPやAEXとは異なり、ACではdsRNAとssRNAを区別できず、mRNAにハイブリダイズしたDNA断片などのその他の生成物に関連する不純物の除去に対して効果的ではありません。このため、一般的なアプローチとしては、最初のクロマトグラフィーステップはACですが、それに続いて、ポリッシングのためにAEXが使用されます。
- 最終濃縮とダイアフィルトレーション は、クロマトグラフィーの各ステップに続いて実行して、製剤純度を最大限に高めて、製剤用または保存用の適切なバッファーにmRNAを移します。この段階では、同じ操作でmRNAの精製、濃縮およびダイアフィルトレーションが可能です。このTFFステップの後に滅菌ろ過を実行できます。ただし、注意すべき点として、分子量が5000 kDa以上のmRNAについては、滅菌グレードでろ過することが難しい場合があります。
mRNAの製剤化
mRNA最終精製ステップの次に考慮すべき事項は、デリバリーのメカニズムです（図4）。デリバリーツールは mRNAワクチン・mRNA治療薬の有効性を確保するために不可欠です。最先端のデリバリーシステムの1つは、脂質とポリマーの結合体です。これらのデリバリーシステムには、オリゴヌクレオチドと脂質との結合により形成される複合体（リポプレックス）やポリエチレンイミン（PEI）などの正電荷ポリマーとの結合により形成される複合体（ポリプレックス）などがあります。mRNAデリバリーに最もよく使用されているのは、脂質ナノ粒子（LNP）です。
図4.複数のmRNAデリバリーシステムが利用可能
脂質を選択する際の考慮事項
脂質を選択する際には、最大の効果と最適な生体内分布が得られるデリバリー経路を考慮する必要があります。脂質の選択に加えて、個々の脂質間の比率も、二重膜の流動性およびLNPの膜融合性に直接影響を与えるため、微調整を行う上で重要な要素です。脂質を選択する際には、複数の極めて重要な要素が関わってきます。脂質の種類、由来、品質は、最終製剤の不純物プロファイルや特性（粒子特性、安定性、放出プロファイルなど）に直接影響を与えます。再現性の高い結果を得るには脂質の品質が均一である必要があり、この脂質品質の均一性は、脂質の合成に使用される原材料の品質や脂質自体の材料特性に大きく左右されます。信頼できるパートナーによる 目的に合わせたサポートとサービス と共に提供される一貫して高品質の合成脂質 は、個々のニーズを満たすために最適であり、最終製剤の最適な性能を確保できます。
LNPは、それぞれ4つの異なる脂質から構成され、mRNAを運搬し、分解から保護します：
- 静電気的相互作用によるRNA封入には、カチオン性／イオン化脂質が必要です。 肝細胞へのデリバリー（タンパク質発現の刺激またはサイレンシングを目的とする）にはイオン化脂質（受動的ターゲティング、エンドソームからの放出）が必要ですが、免疫細胞による取り込みははるかに容易です。強カチオン性脂質も同じように使用でき、細胞質への効率的なRNA放出を担っています。カチオン性脂質の構造は、LNPの活性、毒性、生体内分布に大きな影響を与えます。
- ポリエチレングリコール（PEG）脂質 は、コロイド安定性をもたらし、粒子へのタンパク質の結合を阻止することにより、粒子を免疫系から保護し、血中滞留性を高めます。PEG鎖および脂肪酸鎖の長さは、血中滞留性および膜融合性、すなわち粒子とLNPのエンドソーム膜との融合の程度を決定づけます。血中滞留性を高めるためには、ポリエチレングリコールジステアロイルグリセロール（DSG PEG 2000）などの長い脂肪酸鎖を使用することができます。PEG濃度も粒子径サイズに影響を与えます。ただし、PEGを使用すると抗体形成を引き起こし、免疫付与の効果が損なわれてしまう可能性があります。
- 中性／アニオン性脂質 は、構造的安定性をもたらし、膜融合性および生体内分布を決定づける役割を担います。1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンの例を挙げます。 例えば、エンドソームからの放出に重要な役割を果たす1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）を含むLNPは、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）と比較して、肝臓へのmRNAデリバリーが強化されることが示されました。5 これらのヘルパー脂質は、RNAの安定的な封入にも役立つことが、最近の複数の研究6から示唆されています。
- コレステロール は、LNPの二重膜の密度、流動性および取り込み（ラフト形成）の調整に使用されます。動物由来および合成コレステロールには市販品がありますが、合成コレステロールには、高純度、プリオンなどの動物由来分子を含有しない、大量生産が可能、品質の均一性が高いなどいくつかの利点があります。
精製されたmRNAは、さまざまな方法によってデリバリー粒子に封入できます。一般的に使用される溶媒注入法では、脂質をエタノールなどの溶媒に溶解した後、クロスフロー混合またはマイクロ流路混合を用いて、mRNAを含有する低pHの水性バッファーと速やかに混合し、LNPを作製します。その後、低pHバッファーを中性バッファー中にダイアフィルトレーションし、限外ろ過により粒子を濃縮します。脂質が低pHで加水分解されると、脂質二重膜構造、製剤の安定性や、薬物放出性に影響を及ぼしうる性脂質（hydrolipids）などの不純物が生成する可能性があるため、TFFステップは迅速に実行しなければなりません。脂質が分解されると、粒子サイズが大きくなり、凝集する可能性もあります。
LNPは安定性が極めて高く、構造的柔軟性に優れ、他のデリバリーシステムよりも高い遺伝子デリバリー効率を有します。LNPを利用すると、裸のmRNAを用いるよりも遺伝子導入率が高まり、静脈注射をしても血流中のRNaseにより分解されるリスクがありません。また、特異的なリガンドを搭載すれば、能動的ターゲッティングが可能になります。LNPの短所は、コールドチェーン輸送を必要とする場合があることなどです。また、LNPで常に滅菌ろ過が可能であるとは限りません。そのような場合には、ガンマ線照射、加熱滅菌、高圧滅菌、閉鎖系での操作といった代替手段を検討しなければなりません。
mRNA製剤化の詳細については、ホワイトペーパー「Considerations for Advancing a Lipid Nanoparticle Formulation to Clinical and Commercial Manufacturing」をご覧ください。
スケールアップする際の考慮事項
mRNA製造工程をスケールアップする際には、留意すべきいくつかの考慮事項があります。これらは、小規模スケールでのプロセス開発段階において最優先すべき事項です。
- 溶媒抽出法および沈殿法によるmRNA精製は、スケールアップが難しく 、有害な溶媒の使用はGMP環境に適していません。代わりに、TFFまたはクロマトグラフィーを使用できます。
- mRNAはRNaseにより数秒以内に分解されるため 、対象のmRNAと接触するすべての原材料、溶液および装置はRNaseフリーでなければなりません。
- 適切なデリバリーシステムは、ワクチンまたは治療薬の効率を高めるため、慎重に選択する必要があります。
- 最終製品が粒径の大きいmRNA複合体である場合、滅菌ろ過に代わる手段を評価する必要があります。
- 特別なサプライチェーン要件（コールドチェーン輸送など）は、大幅なコスト増加の要因となります。したがって、医薬品の安定性を慎重に評価する必要があります。
mRNA：輝かしい未来
mRNA技術によって、かつてないスピードでCOVID-19ワクチン候補品の開発および優れた有効性が実現しています。今後、mRNA技術は、感染症の大流行に対する迅速な対応を実現することでワクチン開発分野に革命をもたらすだけでなく、アンメットメディカルニーズへの取り組みに役立つワクチンや治療薬を得るための迅速かつ柔軟なプラットフォームとなる可能性も秘めています。
しかし、この治療法の可能性を最大限に引き出すためには、革新的なソリューション、専門知識および創意工夫を集約させ、生産規模でシンプルかつ堅牢なプラットフォームを確立する必要があります。メルクは、製品、サービス、専門サポートによりお客様の決定プロセスを合理化することで、お客様がmRNA製剤の成功への道を進み、mRNAベースのワクチンと治療薬の製造を共に進歩させられるようにサポートすることに専念しています。
参考文献
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