クロマチン免疫沈降法（ChIP）

免疫沈降法

モノクローナル抗体かポリクローナル抗体か？

適切なChIP抗体の選択は、ChIP実験の成功の鍵を握る最も重要なステップの1つです。通常のウェスタンブロットでの検証において良好に機能する最高品質の抗体であっても、ChIPには適さない場合があります。特にChIPにおいて検証されている抗体のみを検討することが最善です。ご使用の抗体が、特に品質管理およびChIPでの機能の実証が行われた抗体（例：ChIPAb+™検証済み抗体プライマーセット）ではない場合は、実際のChIP実験のために特定の抗体を選択する前に、いくつかの候補抗体を評価することをお勧めします。

モノクローナル抗体とポリクローナル抗体はいずれもChIPに用いることができます。モノクローナル抗体は、標的タンパク質の特定のエピトープを認識します。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、非特異的結合の傾向が少ないという利点があります。また、クローン性のばらつきが少ないため、バッチ間で性能の一貫性が高くなっています。しかし、モノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、プロトコルの上流のステップの架橋などでマスキングされていたり、変化が生じていたりする場合、モノクローナル抗体は、標的タンパク質とそれに関連するDNA配列を単離するのに有効ではありません。幸いなことに、このマスキングがモノクローナル抗体に影響を及ぼすことはほとんどありません。

一方、ポリクローナル抗体は標的タンパク質の複数のエピトープを認識します。このため、仮にいくつかのエピトープが架橋によってマスキングされていても、ポリクローナル抗体はより有効である場合があります。しかし、ポリクローナル抗体は複数のエピトープを認識するため、非特異的結合が起こる可能性が高くなります。また、抗体の精製に用いる血清が、調製や精製の前にプールされていない限り、ポリクローナル集団の特異性が、免疫化の間に経時的に変化する可能性がある点についても考慮することが重要です。同様に、市販されているほとんどのポリクローナル抗体は、バッチ間で異なる可能性があります。ばらつきの程度は、メーカーの製造・品質管理基準によって異なります。例えば、修飾に対するポリクローナル抗体は、利用可能な血清の量が限られており、多くの場合、宿主動物の免疫化から再製造する必要があります。結果として、これらの抗体の特異性や親和性が、バッチによって異なる可能性があります。メルクのような大規模な抗体メーカーは、複数の動物に免疫化を実施し、適切な親和性および特異性を示す材料をスクリーニングおよびプールすることによって、この問題に対処することが可能です。一貫性を保証するため、最終的な抗体の性能を過去のバッチと比較することができます。

モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれを選択するとしても、ChIPのために市販の抗体を選択する際には、特異性を示すデータならびにChIPやその他の主要なアプリケーションにおける信頼性の高い性能を示すデータがある抗体が理想的です。

免疫沈降法のコツ

• ChIP実験のためにモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれを選択した場合でも、特定の解析に合わせて、抗体の希釈率を最適化しなければなりません。抗体を過剰に用いた場合、標的タンパク質の免疫沈降には成功するかもしれませんが、非特異的結合が高くなったり、特異的なシグナルが低下したりする可能性もあります。一方、抗体が少なすぎる場合には、概して標的タンパク質の回収率が低くなります。
• 最良の結果を生むChIP抗体は、特性が詳細に明らかで、標的タンパク質に結合することが実証され、特異性について厳密に試験されており、理想的にはChIPにおいて検証済みであるものが望ましいといえます。
• ある抗体がウェスタンブロットにおいて良好に機能したとしても、クロマチン免疫沈降法において同様であるとは限りません。変性したタンパク質を検出するウェスタンブロットとは異なり、ChIP抗体は非変性状態の標的タンパク質を認識するものでなければなりません。 

免疫沈降物の洗浄

免疫沈降後の抗体、ビーズ、プロテインAまたはGは、抗原認識とは関連のない生体分子が表面に結合していることが多くあります。そのため、ChIP特異的バッファーを用いて一連の洗浄ステップを実施し、非特異的なクロマチン、タンパク質および核酸を免疫沈降物から取り除く必要があります。これらの非特異的成分はバックグラウンドシグナルを著しく増加させ、大きなばらつきを生み、ChIPアッセイの失敗の一因となることがあるためです。場合によっては、複数のバッファー（例：高塩濃度、低塩濃度、塩化リチウム、ストリンジェントなTE洗浄）またはストリンジェンシーを高めるバッファーを用いて、非特異的分子の結合を減らします。

単純なバッファー系を用いるプロトコルもあります。使用する洗浄法を問わず、一貫した洗浄条件を用いる必要があります。バッファー温度、洗浄インキュベーション時間および洗浄に用いる装置の回転速度を一定に維持します。場合によっては、洗浄回数を増やすことによってバックグラウンドシグナルが低減することがありますが、ChIPシグナルの顕著な改善は、使用するChIP抗体の品質とChIP標的の性質によって最終的に決まります。

 

溶出と架橋の反転

溶出と架橋反転のステップは、クロマチン複合体を抗体およびビーズから分離させ、ChIPを実施したDNAをクロマチン複合体のタンパク質部分から単離するために必要です。磁気ビーズを使用した場合、溶出は磁気ラックと適切な溶出バッファー（例：炭酸ナトリウムバッファー）を用いて容易に行うことができます。ペプチド競合アッセイを用いて溶出を行うことも可能です。この場合、抗体／タンパク質／DNA複合体を、抗体に対して標的タンパク質よりも高い親和性を示すペプチドとインキュベートし、標的タンパク質を抗体複合体から外します。この方法では、バックグラウンドシグナルが顕著に低減する可能性がありますが、合成ペプチドのコストのために費用がかかる可能性があります。

炭酸ナトリウムなどの物質を用いた溶出の後、qPCR分析の前に、リジン残基とDNAの間のホルムアルデヒド架橋を反転させることが重要です。通常、架橋は加熱下でプロテイナーゼKとインキュベートすることによって反転させます。フェノール／クロロホルム抽出などの、有機溶媒を組み合わせた抽出によって、DNAサンプルをさらに精製する必要がある場合があります（補足プロトコルを参照）。あるいは、シリカベースのクロマトグラフィー（スピンカラムなど）、磁気DNA精製粒子、Chelex™などのキレート剤によって、消化されたタンパク質／核酸混合物からDNAを精製します。プロテイナーゼK消化の前にRNAse消化ステップを実行し、ChIP反応に由来する夾雑RNAを取り除くことが推奨されます。