저분자 HPLC

소분자의 HPLC

소분자의 HPLC 분석은 역상 분리 모드에서 가장 자주 수행됩니다. 극성 화합물의 분리에는 친수성 상호 작용 크로마토그래피(HILIC)와 정상 상 크로마토그래피도 적합하며, HILIC이 선호되는 방법입니다. 이온 화합물의 분리를 위해 이온 교환 분리 모드와 무기 음이온 또는 양이온의 경우 이온 크로마토그래피도 사용할 수 있습니다.

HPLC 컬럼은 완전 다공성 실리카 입자, 표면 다공성 실리카 입자, 고분자 입자로 채워지거나 모놀리식 실리카 막대를 고정상으로 사용합니다. 또한 산화알루미나, 지르코니아 입자 및 탄소 입자가 사용됩니다. 저분자 분리를 위한 고정상 물질의 일반적인 기공 크기는 60Å - 160Å 범위입니다. HPLC의 경우 고정상의 일반적인 입자 크기는 3µm ~ 5µm 범위이며, UHPLC의 경우 일반적으로 2µm 이하의 작은 입자 크기가 사용됩니다. 고정상에 다양한 컬럼 선택성(변형)을 부착할 수 있습니다. C18 알킬 사슬은 역상(RP) 크로마토그래피에서 가장 일반적으로 사용되는 컬럼 화학입니다. 그러나 C30, C8, 페닐, 펜타플루로페닐 및 이온 교환 또는 키랄 특성을 가진 변형과 같은 다른 변형과 광범위한 극성 변형은 액체에 용해되는 거의 모든 화합물의 분리를 가능하게 합니다. RP-HPLC의 이동상은 일반적으로 수성 완충액 또는 아세토니트릴 또는 메탄올과 같은 물과 물 혼화성 유기 용매로 구성됩니다.

HPLC 시료 전처리

식품, 음료, 화장품, 생물학적 시료 및 매트릭스가 풍부한 제약 제제(예: 크림, 시럽)와 같이 복잡하고 매트릭스가 풍부한 시료에는 원하지 않는 성분을 제거하고 관심 있는 분석물을 선택적으로 추출하기 위한 효율적인 시료 전처리 프로토콜이 필요합니다. 이는 2µm 이하의 입자를 사용하는 UHPLC에서와 같이 입자 크기가 매우 작은 고정상을 사용하는 경우 매우 중요합니다. 일반적인 시료 준비 방법으로는 액체-액체 추출, 고상 추출(SPE), 생물학적 시료의 경우 여과와 함께 단백질 침전이 있습니다. 표적 화합물의 선택적 용출 및 사전 농축 외에도 시료 전처리의 주요 목적은 시료 매트릭스로 인한 막힘으로부터 HPLC 고정상을 보호하는 것입니다. 모놀리식 실리카는 매트릭스를 높은 범위까지 견딜 수 있으며 입자 컬럼보다 훨씬 적은 시료 전처리가 필요합니다.

유도체화

일부 분자의 경우 HPLC 분리 전(컬럼 전) 또는 후(컬럼 후)에 유도체화가 필요합니다. 유도체화는 분자를 유도체로 변환하여 HPLC의 감도 또는 크로마토그래피 보존성을 향상시킵니다. 필요한 유도체화에는 바람직한 물리적 및 화학적 특성을 가진 화학 시약이 사용됩니다.