프로토콜 지침: 항체를 이용한 전체 마운트 오가노이드의 면역형광 염색

오가노이드는 복잡한 3차원 구조를 가지고 있으며 특성화를 어렵게 하는 ECM 하이드로겔에 포매되어 있습니다. 항체를 이용한 오가노이드의 면역형광(IF) 염색은 세포의 행동, 증식, 분화, 세포 건강 및 식별에 대한 분자 표지자를 시각화하기 위해 수행됩니다. 전체 마운트 면역염색법은 조직의 작은 조각들을 절단하지 않으며 이 방법은 동결절편에서 면역세포화학(ICC) 또는 면역조직화학(IHC) 염색법과 매우 유사합니다. 오가노이드의 전체 마운트 염색은 항체 기반 특성화에 사용될 수 있습니다. 이 오가노이드 염색 프로토콜에서는 면역형광 공초점 현미경으로 분석하기 위해 전체 마운트 오가노이드를 고정, 투과화, 염색하는 방법을 자세히 설명합니다.

그림 1. 항체를 이용한 오가노이드의 면역형광. Acetyl-α-Tubulin (A), α-Carbonic Anhydrase IV (B), Sox-9(AB5535) (C)를 위해 항체를 이용한 인간 상피 장 및 폐 오가노이드 염색.

오가노이드 염색 프로토콜

1. 오가노이드 배양에서 배지를 제거하고 1X PBS(D8537)로 부드럽게 2회 수세합니다.
2. 30-40개의 오가노이드 Matrigel　돔을 10 cm 디쉬에서 4% PFA(1.00496) 15-20 mL를 이용하여 30-60분 동안 실온에서 고정합니다.  
   참고: Matrigel은 PFA에서 고정될 때 일부 용해될 것입니다. 
3. 디쉬를 때때로 스월링하여 Matrigel이 서로 붙지 않게 하며 Matrigel로부터 오가노이드를 분리합니다. 
   참고: 모든 오가노이드가 Matrigel에서 분리되는 것은 아닙니다.
4. 10 cm 디쉬의 고정액 15-20 mL를 50 mL 원뿔 튜브에 붓고 오가노이드가 중력에 의해 튜브 바닥에 침전되도록 합니다(약 10-15분). 
5. 중력에 의해 50 mL 원뿔 튜브 바닥에 오가노이드가 침전되고 나면, 조심스럽게 고정액을 흡입하되 그 과정 중에 오가노이드 펠릿을 흡입하지 않도록 주의합니다. 
6. 1X PBS(D8537) 15-20 mL를 4단계의 디쉬에 추가하고 실온에서 15-20분 동안 방치합니다.
7. 15-20분이 다 되면, 디쉬를 추가로 스월링하여 Matrigel 돔이 서로 붙지 않게 하고 1X PBS(D8537)를 5단계의 오가노이드 펠릿이 들어있는 50 mL 원뿔 튜브에 붓습니다.
8. 5-7단계를 3회 더 반복합니다.
9. 오가노이드 펠릿에 손상이 가지 않도록 용액을 흡입하고 오가노이드 펠릿이 들어있는 50 mL 원뿔 튜브에 1X PBS(D8537) 5 mL를 분주하여 추가한 뒤 튜브를 스월링하여 오가노이드 펠릿을 재현탁합니다.  
   참고: 피펫을 위아래로 움직이면서 피펫팅하지 마십시오. 그렇게 하면 오가노이드의 대부분이 부서집니다.
10.  오가노이드 덩어리가 들어있는 1X PBS(D8537) 5 mL를 서로 들러붙어 있는 오가노이드 Matrigel 돔이 들어있는 10 cm 디쉬에 직접 붓습니다.
11. 별개의 1X PBS(D8537) 5 mL를 50 mL 원뿔 튜브에 추가하여 가능한 한 많은 오가노이드 덩어리를 수집하고 오가노이드가 들어있는 10 cm 디쉬에 직접 붓습니다.
12. 즉시 사용하지 않는 경우, 10 cm 디쉬를 파라필름으로 밀봉하여 4°C 냉장고에서 최대 1개월까지 저장합니다. 
13. 면역형광 염색을 수행할 준비가 되면, 고정된 오가노이드가 들어있는 10 cm 디쉬를 냉장고에서 꺼내 해부현미경 하에서 관찰합니다.
14. 1 mL 피펫 팁을 절단하여 배럴을 충분히 크게 만들어서 오가노이드가 잘리거나 부서지지 않게 흡입하도록 합니다.
15. 오가노이드(1-4)를 8웰 챔버 슬라이드로 옮기고 남아있는 1X PBS(D8537)는 P-200 피펫으로 제거합니다.  오가노이드가 흡입되거나 팁을 자르지 않은 P-200 팁에 의해 절단되지 않도록 하십시오.
16. 고정된 오가노이드를 차단 버퍼(5% 말 혈청 및 0.5% Triton X-100이 함유된 1X PBS) 0.5 mL로 4°C에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 2-4시간 동안 투과화시킵니다.  참고: 2차 항체의 숙주와 동일한 종의 혈청 사용을 권장합니다.
17. 오가노이드가 있는 챔버 슬라이드에서 차단 버퍼를 P-200 피펫으로 제거합니다.  P-200 팁을 통해 오가노이드를 피펫팅하지 마십시오.
18. 차단 버퍼에서 1차 항체(300-500 µL) 또는 직접 접합된 항체(300-500 µL)를 준비합니다.
19. 희석된 항체를 오가노이드가 들어있는 적절히 라벨을 붙인 웰에 추가합니다.
20. 하룻밤 동안 4°C에서 배양합니다.
21. 다음날, 1X PBS(D8537)로 3회 세척하며, 각 세척은 10-15분 동안 수행됩니다. 참고: 직접 접합된 항체 시료가 공초점 현미경에서 이미지를 얻을 준비가 된 경우.
22. 비접합 1차 항체를 이용할 경우, 적절히 표지된 시료에 대해 차단 버퍼에 2차 항체(300-500 µL)를 준비합니다.
23. 하룻밤 동안 4°C에서 2차 항체를 염색합니다.
24. 다음날, 1X PBS(D8537)로 3회 세척하며, 각 세척은 10-15분 동안 수행됩니다.
25. 오가노이드가 들어있는 각각의 웰에서 차단 버퍼를 P-200 피펫으로 제거합니다.  P-200 팁을 통해 오가노이드를 피펫팅하지 마십시오.
26. 1X PBS(시료당 300-500 µL)에 5 µg/mL 농도의 DAPI(D9542)를 추가하여 핵 염색을 준비합니다.
27. DAPI 염색액을 각각의 시료에 추가하고 실온에서 15-20분 동안 배양합니다.
28. 1X PBS(D8537)로 3회 세척하며, 각 세척은 10-15분 동안 수행됩니다.
29. 시료는 공초점 현미경에서 이미지를 얻을 준비가 되었습니다.