표준 PCR 프로토콜

PCR 수행 방법

표준 중합효소연쇄반응(PCR) 설정은 4단계로 구성됩니다.

1. 필요 시약 또는 마스터믹스 및 템플릿을 PCR 튜브에 추가합니다.
2. 혼합 및 원심분리합니다.
3. 가열 뚜껑이 없는 열 순환기에서 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일을 추가합니다.
4. 열 순환기 및 프라이머 매개변수에 따라 증폭합니다.
5. 아가로스 젤 전기영동을 통해 증폭된 DNA를 평가한 후 에티듐 브로마이드 염색을 수행합니다.

이 단계는 재료 및 시약 선택 팁과 함께 아래에 자세히 설명되어 있습니다. 이것은 Taq DNA 중합효소를 사용하는 기본 PCR 프로토콜입니다.

PCR 단계 및 필수 PCR 구성 요소

PCR 반응의 문제 해결에는 여러 가지 요인이 관여합니다. 이 애니메이션을 시청하여 필요에 맞는 구성 요소와 사이클 조건을 선택하면 최적의 결과를 얻을 수 있는 방법을 알아보세요.

다른 중합효소 또는 고급 PCR 기술에 대한 추가 프로토콜은 PCR 기술 가이드의 프로토콜 섹션에서 찾아볼 수 있습니다.

표준 PCR의 정의 등 자세한 내용은 PCR 기본 페이지.

시약: PCR에 필요한 시약은 무엇인가요?

PCR에 사용되는 시약	권장 제품
Taq DNA 중합효소	사용자 선호도에 따라 Taq DNA 중합효소를 선택합니다. (아래 별도의 Taq 중합효소 표 를 참조하세요.)
PCR 등급 물	PCR 시약 물
작업 농도로 희석한 프라이머	10µM 작업용 스톡은 대부분의 분석에 충분합니다.
올리고	맞춤형 올리고
증폭할 DNA	연구자 제공
전용 피펫
열 순환기	다양한 웰 블록 크기 또는 멀티포맷
멸균 필터 피펫 팁
멸균 1.5mL 스크류 탑 미세원심분리기 튜브	Corning® 스크류 캡이 있는 미세원심분리기 튜브	./td>
PCR 튜브 또는 플레이트	사이클러에 맞게 선택합니다:
	개별 얇은 벽 200 µL PCR 튜브
	200 µL 스트립 튜브
	멀티웰 플레이트 및 플레이트 씰
dNTP 믹스	데옥시뉴클레오타이드 믹스;dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각 10mM 함유 *readymix에는 이미 dNTP가 포함되어 있습니다

Taq 중합효소란 무엇인가요?

Taq DNA 중합효소는 호열성 박테리아인 '써머스 아쿠아티쿠스'에서 추출한 열 안정성 효소입니다.에서 발현되는 재조합 형태입니다. 이 효소는 95°C까지 반복적으로 가열해도 (PCR 기술에서 요구하는 대로) 큰 활성 손실 없이 견딜 수 있습니다. 이 효소의 분자량은 SDS-PAGE 기준 약 94kDa이며 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 활성은 검출되지 않습니다. 5'→3' DNA 중합효소 활성과 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지고 있습니다. 각 로트의 Taq> DNA 중합효소는 PCR 증폭 및 이중 가닥 염기서열 분석을 위해 테스트됩니다. 효소는 5단위/µL로 공급되며 최적화된 10배 반응 버퍼와 함께 제공됩니다.

Standard  Taq  ./i>DNA 중합효소

아래 표를 사용하여 반응 조건에 맞는 적절한 혼합의 Taq & nbsp;DNA 중합효소를 선택하세요. 염화마그네슘(MgCl₂) 유무에 관계없이 투명 또는 적색 염색 제제 또는 미리 준비된 레디믹스 또는 버퍼 및 dNTP가 포함된 마스터 믹스 중에서 선택합니다.

MgCl2 포함 및		별도 MgCl2	Readymix                      .
염료가 없는 투명한 제형	적색 염료로 젤에 직접 로드	염료가 없는 투명한 제형< /td> .../td>	젤에 직접 로드하기 위한 적색 염료 포함	염료가 없는 투명한 제형
DNA 중합효소 from & nbsp;.nbsp;Thermus aquaticus(D1806)	REDTaq® DNA Polymerase (D4309)	MgCl2가 없는 Thermus aquaticus 유래 Taq DNA 중합효소 (D4545)	REDTaq® ReadyMix™ (R2523)	ReadyMix™ Taq PCR 반응 믹스 (P4600)

단위 정의: 한 단위는 74°C에서 30분 동안 총 데옥시리보뉴클레오사이드 삼인산염 10nmol을 산 침전 가능한 DNA에 통합합니다.

프로세스: PCR 단계

Taq DNA 중합효소, 템플릿 DNA, 프라이머 및 MgCl2 농도에 대한 최적의 조건은 사용 중인 시스템에 따라 달라집니다. 각 개별 구성 요소에 대한 최적의 조건을 결정해야 할 수도 있습니다. 이는 특히 Taq> DNA 중합효소, 사이클링 파라미터 및 MgCl₂ 농도에 해당됩니다. 최적의 효율을 결정하기 위해 효소와 MgCl₂를 적정하는 것이 좋습니다.

1. 적절한 크기의 튜브에 시약을 표에 제공된 순서대로 추가합니다. (반응 설정에 적합한 표를 선택합니다: 표준 또는 레디믹스 시약) 반응 수가 많은 경우 템플릿이 없는 마스터믹스를 설정하고 반응 튜브에 분주해야 합니다. 마지막에 적절한 튜브에 템플릿을 추가해야 합니다.
   

표준 PCR 반응

양	성분	최종 농도
w µL	물
5 µL	10배 PCR 버퍼(P2192 또는 P2317)*	1x
1 µL	데옥시뉴클레오티드 믹스	200 µM
w µL	전진 프라이머 (일반적으로 15-30 염기 길이)	0.1-0.5 µM
x µL	역전 프라이머 (일반적으로 15-30염기 길이)	0.1-0.5 µM
0.5 µL	Taq DNA Polymerase*	0.05 units/µL
y µL	시료 DNA(일반적으로 10ng)	200 pg/µL
z µL	25mM MgCl2(버퍼와 함께만 사용 P2317)	0.1-0.5mM
50 µL	총 반응량

*버퍼와 Taq 중합효소 함께 구매: D1806, D4309 또는 D4545

Readymix PCR 반응

양	성분	최종 농도
25 µL	Readymix (R2523 또는 P4600)
w µL	전진 프라이머 (일반적으로 15-30 염기 길이)	0.1-0.5 µM
x µL	역전 프라이머 (일반적으로 15-30 염기 길이)	0.1-0.5 µM
y µ.L	템플릿 DNA(일반적으로 10ng)	200 pg/µL
z µL	물
50 µL	총 반응량

2. 보텍스에 의해 부드럽게 혼합하고 간단히 원심분리하여 모든 성분을 튜브 바닥에 모으십시오.

주: 가열 뚜껑이 없는 열 순환기를 사용하는 경우 증발을 방지하기 위해 각 튜브 상단에 50µL의 미네랄 오일을 추가합니다.

3. 증폭. 증폭 파라미터는 사용하는 프라이머와 열 순환기에 따라 달라집니다. 개별 프라이머, 템플릿 및 열 순환기에 맞게 시스템을 최적화해야 할 수도 있습니다.

일반적인 증폭 파라미터

25~30주기의 증폭이 권장됩니다.

PCR 단계	온도 °C	지속 시간
변성 템플릿	94°C	1분
어닐 프라이머	55 °C	2 min
연장	72 °C	3분

4. 증폭된 DNA는 아가로스 겔 전기영동 및 후속 에티듐 브로마이드 염색

    참고: 미네랄 오일 오버레이는 단일 클로로포름 추출(1:1)로 제거하여 수성상을 회수할 수 있습니다.

핵산 전기영동용 시약

• 아가로오스 (프리캐스트 젤, 분말 등....)
• 완충액(예: MOPS-EDTA-초산나트륨, 트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 또는 트리스-보레이트-EDTA(TBE)
• RNA용 겔 로딩 용액 및 샘플 로딩 버퍼
• 전기영동 염색 또는 염료(예: 에티듐 브로마이드)

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