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웨스턴 블로팅 프로토콜(면역 블로팅 프로토콜)

웨스턴 블로팅은 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔에서 PVDF 또는 니트로셀룰로오스 멤브레인 시트로 단백질을 전기영동을 통해 전달한 후 형광 또는 화학발광 검출법으로 항체를 이용한 단백질을 면역 검출하는 과정을 말합니다.

웨스턴 블로팅 워크플로 단계

시료 조제: 세포 용해 및 단백질 추출
SDS-PAGE 겔 전기영동법
멤브레인 전달
a) 탱크 전달
b) 반건식 전달
면역검출
a) 기존 면역검출
b) SNAP i.d.^® 시스템을 이용한 30분 면역검출 프로토콜
문제해결 지침

멤브레인 전달(탱크 전달) 프로토콜

재료

블로팅 페이퍼
전달 멤브레인(예: Immobilon^® PVDF 멤브레인)
전달 버퍼
메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올
탱크 전달 시스템(예: SB10 omniPAGE 소형 일렉트로블로팅 시스템)
전원 공급

설정

전달 버퍼는 전달 탱크를 채울 만큼의 양과 겔 및 멤브레인의 균형 유지 용도로 200 mL를 추가로 준비하고 여과지를 적십니다.
카세트에서 겔을 제거하고 달라붙은 겔과 웰을 모두 잘라냅니다.
전달 버퍼에 겔을 10분에서 30분 동안 담가 놓습니다.
전달 버퍼에 여과지를 30초 이상 담가 놓습니다.
멤브레인 제조:

    a. PVDF 멤브레인을 사용하는 경우 메탄올에 멤브레인을 15초 동안 담급니다. 멤브레인은 불투명에서 반투명으로 균일하게 변해야 합니다.

    b. Milli-Q^® 워터에 멤브레인을 조심스럽게 넣고 2분 동안 담가 놓습니다.
    c. 전달 버퍼에 멤브레인을 조심스럽게 넣고 최소 5분 이상 평형을 유지합니다.

전달 스택 조립

카세트 홀더를 개방합니다.

중요: 균일한 전달을 위해 블롯 롤러를 사용하거나 피펫 또는 교반 막대를 스택의 각 층 표면 위에서 조심스럽게 돌려가며 층간 기포를 제거하십시오. 멤브레인과 겔의 손상을 방지하려면 과도한 압력을 가하지 마십시오.
카세트 한쪽에 폼(섬유 재질) 패드를 놓습니다.
패드 위에 여과지 한 장을 놓습니다.
여과지 위에 겔을 놓습니다.
겔 위에 멤브레인을 올려 놓습니다.
두 번째 여과지를 스택 위에 놓습니다.
필터 용지 위에 두 번째 폼 패드를 놓습니다.
카세트 홀더를 닫습니다.

단백질 전달 방법(탱크 전달)

카세트 홀더의 겔 면이 음극(–)을 향하고 멤브레인 면이 양극(+)을 향하도록 카세트 홀더를 전달 탱크에 놓습니다.
탱크에 버퍼를 적절하게 추가하여 카세트 홀더를 덮습니다.
검은색 음극 리드(–)를 음극 잭에, 빨간색 양극 리드(+)를 전달 장치의 양극 잭에 삽입합니다.
양극 리드와 음극 리드를 해당 전원 출력에 연결합니다.
가능한 경우 제조업체의 지침에 따라 탱크 전달 장치에 냉각 장치를 설치합니다.
6-8 V/cm의 전극간 거리에서 1-2시간 동안 시스템을 켜놓습니다. 세부 사항에 대한 최적화는 탱크 제조업체의 지침을 따르십시오.
전달이 끝나면 탱크에서 카세트 홀더를 분리합니다.
집게 가위를 사용하여 전달 스택을 조심스럽게 해체합니다.

성공적인 웨스턴 블로팅 전달을 위한 팁

두 가지 유형의 전달 시스템(탱크 및 반건식)에서는 여과지, 겔 또는 멤브레인 사이의 어느 곳에도 기포가 유입되지 않도록 각별히 주의해야 합니다.
정전류에서 단백질을 전달하십시오. 정전압에서 전달하는 경우 전류를 모니터링하여 0.4 A를 초과하지 않도록 하십시오. 전류가 너무 높을 경우 100 V부터 시작하여 전압을 점차 줄입니다.
더 진한 겔이나 더 큰 단백질의 경우 전달 시간을 늘리거나 장의 세기를 증가시켜야 할 수 있습니다. 실제 전달 조건은 각 시스템에 맞춰 최적화되어야 합니다.
Immobilon® 전달 멤브레인의 양면은 균일하게 작용합니다. 어느 한쪽의 외양(반짝이거나 탁한)은 멤브레인의 전달 및 검출 효율에 영향을 주지 않습니다.
소형 펩타이드를 포함하는 시료의 경우 전달 버퍼 내 겔의 평형화는 10분 이내로 제한해야 합니다.
목적 단백질이 20 kDa 이하인 경우 최대 보존을 위해 Immobilon® PSQ를 사용하십시오.
형광 검출 방법을 위해서는 Immobilon®-FL 전달 멤브레인을 사용하십시오.
겔은 개별적으로 전달할 수 있으며 복합적인 겔을 단일 스택에서 전달할 수 있습니다.

반건식 멤브레인 전달 프로토콜

재료

블로팅 페이퍼
전달 멤브레인(예: Immobilon^® PVDF 멤브레인)
양극 버퍼 I: 0.3 M Tris, pH 10.4, 10 %(v/v) 메탄올
양극 버퍼 II: 25 mM Tris, pH 10.4, 10 %(v/v) 메탄올
음극 버퍼: 25 mM Tris, 40 mM 6-아미노-n-카프로산(글리신 대체 가능), 10 %(v/v) 메탄올, pH 9.4
반건식 블로터(예: 제품 B2529번)
전원 공급

설정

각 양극 버퍼 200 mL와 음극 버퍼 400 mL를 준비합니다.
카세트에서 겔을 분리하고 달라 붙은 겔을 모두 잘라냅니다.
음극 버퍼 200 mL에 15분 동안 겔을 담가 놓습니다.
양극 버퍼 I에 여과지 두 장을 30초 이상 담급니다.
양극 버퍼 II에 여과지 한 장을 30초 이상 담급니다.
세 장의 여과지를 음극 버퍼에 30초 이상 담급니다.
멤브레인 제조:
    메탄올에 멤브레인을 15초 동안 적십니다. 멤브레인은 불투명에서 반투명으로 균일하게 변해야 합니다.
    b. Milli-Q^® 워터에 멤브레인을 조심스럽게 넣고 2분 동안 담가 놓습니다.
    c. 양극 버퍼 II에 멤브레인을 조심스럽게 넣고 최소 5분 이상 평형을 유지합니다.

단일 전달의 경우:

평평한 벤치 상단에 양극 전극판을 놓습니다.
양극 버퍼 I에 담근 여과지 두 장을 전극판의 가운데에 놓습니다.
양극 버퍼 II에 담근 여과지를 처음 놓은 두 장의 여과지 위에 놓습니다.
여과지 위에 멤브레인을 놓습니다.
멤브레인 위에 겔을 놓습니다.
멤브레인 위에 음극 버퍼에 담근 여과지 세 장을 놓습니다.
음극 전극판을 스택 위에 놓습니다.

다중 전달의 경우:

평평한 벤치 상단에 양극 전극판을 놓습니다.
양극 버퍼 I에 담근 여과지 두 장을 전극판의 가운데에 놓습니다.
양극 버퍼 II에 담근 여과지를 처음 놓은 두 장의 여과지 위에 놓습니다.
여과지 위에 멤브레인을 놓습니다.
멤브레인 위에 겔을 놓습니다.
마지막 겔은 10단계로 이동합니다.
음극 버퍼에 담근 여과지 한 장을 겔 위에 올려놓습니다.
투석 멤브레인 한 장을 여과지 위에 놓습니다.
양극 버퍼 II에 담근 여과지 한 장을 투석 멤브레인 위에 놓습니다.
모든 겔(장치의 최대량까지)이 스택에 합쳐질 때까지 4-8단계를 반복합니다.
음극 버퍼에 담근 여과지 세 장을 마지막 겔 위에 놓습니다.
음극 전극판을 스택 위에 놓습니다.

중요: 작업 중 음극판 커버를 부딪히지 않도록 주의하십시오. 전달 스택의 정렬을 방해하여 부정확한 결과를 초래할 수 있습니다.

단백질 전달 방법(반건식)

검은색 음극 리드(–)를 음극판 잭에 삽입합니다.
빨간색 양극 리드(+)를 양극판 잭에 삽입합니다.
양극 리드와 음극 리드를 해당 전원 공급 장치 출력에 연결합니다.
전원 공급 장치를 켭니다.
전류를 설정하고 다음 도표에 표시된 시간 동안 작동시킵니다.

표 1.반건식 단백질 전달을 위한 권장 시간
전류 밀도	시간 제한
0.8 mA/cm²*	1-2시간
1.2 mA/cm²	1시간
2.5 mA/cm²	30-45분
4.0 mA/cm²	10-30분

*표면적(cm²)은 양극판에 있는 스택이 차지하는 치수로 계산됩니다. 이 값은 스택의 겔 수량과는 별개입니다.

기존 면역검출

재료

1차 항체와 2차 항체
오비탈 셰이커*(제품 Z768499번)
2-3 mm 깊이 수반으로 블롯 크기보다 약간 큽니다.
검출 기질(페록시다아제-항체 접합체 또는 포스파타아제-항체 접합체와 함께 사용)
- 화학발광 기질
- 발색 기질

*셰이커 및 수반은 기존 면역검출 방식에서만 필요합니다.
SNAP i.d.^® 시스템을 이용하는 급속 진공 구동식 면역검출의 경우 SNAP i.d.^® 면역검출 프로토콜을 참조하십시오.

항체 배양

차단 용액에 블롯을 넣고 1시간 동안 교반기에서 배양합니다.
1차 항체 용액(예: 단클론 항베타-액틴 항체)에 블롯을 넣고 1시간 동안 교반기로 배양합니다. 용액은 멤브레인의 표면을 통과하여 자유롭게 이동해야 합니다.
PBS에 블롯을 넣고 10분 동안 세척합니다. 새로운 버퍼를 사용하여 두 번 반복합니다.
2차 항체 용액에 블롯을 넣고 RT 또는 37 °C에서 1시간 동안 교반기로 배양합니다.
PBS에 블롯을 넣고 10분 동안 세척합니다. 새로운 버퍼를 사용하여 두 번 반복합니다.
발색, 화학발광 또는 형광 검출을 진행합니다. 또한 단백질 검출 관련 리소스를 관찰합니다.
단백질의 발색 및 화학발광 검출
BCIP/NBT 기질을 이용한 면역검출

화학발광 검출법

제조업체의 지침을 따르십시오.

제조업체의 지침에 따라 기판을 준비합니다.
블롯을 용기에 넣고 기질을 추가하여 멤브레인을 완전히 덮습니다.
1분간 배양합니다.
과다한 기질을 배출합니다.
깨끗한 유리판에 블롯을 놓고 포장용 랩으로 둘러쌉니다.
참고: 크기에 맞춰 자른 시트 프로텍터나 냉동용 팩을 사용할 수도 있습니다.
기포를 조심스럽게 제거합니다.
암실에서 싸여진 멤브레인을 필름 카세트에 놓습니다.
방사능 촬영 필름 시트를 위에 놓고 카세트를 닫습니다.
필름을 노출시킵니다. 최적의 노출 시간을 결정하려면 15초에서 30분까지 다중 노출을 시켜야 합니다. 일반적으로 1-5분 동안 노출시킵니다.

형광 검출법

필요 장비

Immobilon^®-FL 전달 멤브레인 위에 단백질이 블로팅되고 항체와 함께 탐지됩니다.
Mylar^® 랩입니다.
형광 영상 장비입니다.

다음은 형광 면역검출을 위한 일반적인 프로토콜입니다. 최적의 결과를 얻으려면 시약과 함께 제공된 제조업체의 프로토콜을 참조하십시오.

참고: 화학발광 시약을 사용하는 경우 시약 제조업체의 지침을 따르십시오.

희석시킨 형광 염료 표지 2차 항체 용액에 블롯을 넣고 부드럽게 교반시키면서 1시간 동안 배양합니다.
워시 버퍼를 사용하여 블롯을 5분씩 3-5회 세척합니다.
깨끗한 여과지 한 장에 블롯을 놓고 건조시킵니다.
랩을 사용하는 경우 Mylar^®를 사용합니다. Saran™ 랩은 빛을 반사시켜 형광을 차단하므로 사용하지 마십시오.
적절한 형광 스캐너를 사용하여 블롯을 시각화합니다.

표 2.웨스턴 블로팅 문제해결 지침
문제	가능한 원인	해결책
신호가 없거나 약함 또는 비특이성 밴드	기판 또는 접합체가 약하거나 노후 또는 부적절한 보관으로 더 이상 활성화되지 않을 수 있습니다.	접합부와 기판의 활성도를 테스트합니다. 예를 들어 효소 결합액을 기질 용액에 첨가합니다. 색이 바뀌어야 합니다.
	화학발광 검출을 사용하는 경우 필름 현상액의 수명이 만료되었을 수 있습니다.	새로운 필름 현상액을 사용합니다.
	적절하지 않은 기질 적용	선택된 기질이 효소 결합에 적합한지 확인합니다.
	기판을 잘못 준비함	기판에 동봉된 지침을 따릅니다. 필요한 경우 새로운 H₂O₂를 추가합니다.
	1차 항체 또는 2차 항체가 잘못 희석됨	사용 중인 항체에 대해 권장된 희석률이 있는지 문헌이나 데이터 시트를 확인합니다. 다양한 희석제를 사용해 봅니다. 특히 화학발광과 같은 민감한 검출 시스템에서는 많을수록 더 좋은 것은 아닙니다. 대부분의 항체는 민감하지 않은 유색 기질로 검사가 가능합니다. 이러한 이유로 화학발광 검출 시 항체를 5-10배 더 희석해야 할 수 있습니다. 당사의 2차 항체 지침에서 2차 항체를 선택하는 방법에 관한 팁을 확인하십시오.
	용도에 적합하지 않은 1차 항체	항체가 면역 블로팅에서 효과를 나타냈는지 확인합니다. 모든 항체가 모든 용도에서 작용하는 것은 아닙니다. 1차 항체는 연구되는 종의 목적 단백질과 반응하지 않을 수도 있습니다. 문헌/데이터 시트와 단백질 서열 정보를 확인합니다.
	목적 단백질이 없거나 소량 존재합니다	양성 조절이 작용하는 경우 단백질 부하량을 확인합니다. 필요한 경우 면역 수용이나 정제에 의해 적재된 시료 내 목적 단백질의 양을 강화하십시오. 당사의 로딩 조절 항체 중 하나를 사용하여 단백질이 올바르게 전달되도록 하십시오. 목적 단백질과 관련하여 참조할 수 있는 가장 좋은 출처는 문헌입니다. 아래의 "단백질 전달 불량"을 참조하십시오.
	2차 항체를 적용하기에 부적합함	2차 항체는 1차 항체와 결합하지 못할 수도 있습니다. 멤브레인 조각 위에 1차 항체를 소량 찍어서 검사합니다. 스폿이 마르면 반응을 정지한 다음 희석된 2차 항체로 탐지, 세척하고, 기질을 이용하여 현상합니다. 2차 항체가 1차 항체에 바인딩된 경우 스폿이 나타나야 합니다.
	배양 시간이 부적절함	1차 항체로 1시간 이상 배양합니다.
	효소 억제제의 존재	아지드화 나트륨은 페록시다아제 반응을 억제합니다.
	과도한 세척	세척 시간을 단축하고 워시 버퍼에서 계면활성제를 제거합니다.
	단백질 전달 불량	반응 정지 전에 폰소 S(제품 P7170번)로 멤브레인을 염색하여 단백질이 멤브레인으로 전달되는지 확인합니다. 단백질 전달 전에 멤브레인이 균일하게 적셔지도록 하십시오. 전달 시간을 테스트합니다. 작은 단백질(10,000 미만)이 멤브레인을 통해 전달될 수 있습니다(1차 멤브레인 뒤에 2차 멤브레인을 추가해 보십시오). 단백질의 크기가 클수록 전달 시간이 길어질 수 있습니다. 전달 버퍼 점검 - 메탄올 농도가 높으면 겔에서 단백질이 전달되지 않을 수 있습니다. 전달 버퍼 내 0.005-0.01 % SDS는 겔에서 단백질 전달을 증가시킬 수 있지만 멤브레인의 단백질 결합을 방해할 수도 있습니다. 단백질의 pI가 9.0을 초과하는 경우 CAPS, pH 9를 전달 버퍼로 사용해 보십시오. 당사의 로딩 조절 항체 중 하나를 사용하여 단백질이 올바르게 전달되도록 하십시오.
	잘못된 보관 및 취급 때문에 시약의 활성도가 소실되었을 수 있습니다.	생성물 데이터시트에서 보관 지침을 확인하십시오. 과도한 동결/해동을 삼가십시오. 형광단 접합 항체의 경우 해당 항체가 빛에 노출되지 않았는지 확인하십시오.
강한 백그라운드 또는 비특이성 밴드	불충분한 정지	기타 정지 방법을 시도해 봅니다. 정지 시간이 길거나 정지액의 농도가 높거나 다른 정지액을 사용한 경우 항체 희석액에 단백질 차단제를 포함하거나 동일한 차단제를 새로운 배치에 사용해 보십시오.
	1차 항체의 특이성이 충분하지 않을 수 있습니다.	단클론 방식 또는 정제된 친화력을 가진 다클론성 항체를 사용해 보십시오.
	고농도 1차 항체	문헌이나 데이터 시트에서 권장되는 1차 희석액을 확인합니다. 시스템을 최적화하려면 다양한 희석액을 사용해 보십시오.
	고농도 2차 항체	추가적인 시료 레인을 실행하고 실험 절차에서 1차 항체 배양을 생략하여 테스트합니다. 이러한 "2차 항체만 존재"하는 대조군이 비특이적 염색을 나타낸다면 2차 항체를 더 희석하거나 다른 2차 항체를 사용해 보십시오.
	2차 항체는 시료 내 다른 단백질과 교차 반응합니다.	시료와 동일한 종에서 1~5%의 정상 혈청이 함유된 버퍼에 2차 항체를 넣어 희석합니다. 당사의 2차 항체 지침에서 2차 항체를 선택하는 방법에 관한 팁을 확인하십시오.
	복합 밴드는 목적 단백질이 가수 분해된 조각일 수 있습니다.	시료 제조의 첫 번째 단계에서 단백질분해효소 억제제가 존재하는지 확인합니다. 단백질 분해 가능성을 줄이는 방식으로 시료 제조를 보관 및 취급합니다. 가능하다면 새로운 시료를 사용해 봅니다.
	필요 이상으로 긴 항체 배양 시간	배양 시간을 단축합니다.
	발색 기질 용액에 과배양함	염색 시간을 단축합니다. 양성 신호를 나타낼 때까지 기질에 멤브레인을 노출시킵니다. 백그라운드가 성장하기 전에 멤브레인을 세척하여 반응을 정지합니다.
	부적절한 세척	세척 횟수 또는 세척 강도를 증가시킵니다.
	시료에 오염된 효소가 존재	기질만 사용하여 시료를 검사하고 단백질 시료의 오염 효소 활성도를 확인합니다.
검은색 스폿	차단 시약이 응괴되었으며 항체가 이 시약에 결합되고 있습니다.	차단 시약을 여과하십시오.
	오염 효소가 시료에 들어 있거나 차단 버퍼를 오염시키고 있습니다.	차단 버퍼를 여과하십시오.
밴드가 평행하지 않음	겔이 평행 상태에서 중합되지 않았습니다.	겔 준비 절차를 다시 살펴보십시오.