탄소의 수수께끼: 다공성 흑연탄소(PGC) 고정상의 물질적 기초와 유지 특성
서론
기존의 액체 크로마토그래피(LC) 고정상과 비교했을 때 독특한 특성을 지닌 다공성 흑연탄소(PGC)는 1980년대부터 사용되어 왔습니다. 당시 목표는 실리카 지지체 기반의 표준 역상(RP) 상의 장점을 유지하면서도 제한된 pH 범위, 낮은 온도 안정성, 활성 표면 실란올로부터의 2차 상호작용과 같은 부정적 특성을 제거한 물질을 개발하는 것이었습니다. 연구자들은 표준 RP 상과 일부 중첩되는 특성이 존재하지만, 일정 수준의 흑연화(graphitization)가 이 물질에 다른 독특한 특성을 부여한다는 사실을 발견했습니다. 이러한 흑연 특유의 특성들 덕분에 PGC는 기존 전통적 옵션이 효과적이지 않은 더 까다로운 분리 작업에 특화된 특수상으로서 자리매김하게 되었습니다.
간략한 역사 강의
PGC에 관한 최초의 논문은 1982년으로 거슬러 올라가며, Gilbert 등은 이 상이 가스 크로마토그래피(GC)와 액체 크로마토그래피(LC) 모두에서 유용함을 입증했습니다.1 당시 이 물질은 다공성 유리탄소(Porous Glassy Carbon)로 불렸습니다.
용어는 다소 다르지만, 오늘날 HPLC 컬럼에 사용되는 상용 PGC 재료를 설명하는 데 매우 유사하고 어느 정도 적절한 용어라 할 수 있습니다. 이후 에든버러 대학의 존 녹스 교수(John Knox)와 다른 연구진들이 이 물질의 가공 과정을 연구하고 최적화하여, HPLC 컬럼에 충전하기에 적합한 물질을 개발했습니다.2 그 이후로 또 다른 PGC 고정상 물질인 Supel™ Carbon LC가 출시되었는데, 기존 PGC 상과 많은 유사점을 가지면서도 몇 가지 차이점도 있습니다.
입자 형태학
액체 크로마토그래피용 PGC 고정상에서 유지(retention)가 어떻게 결정되는지 이해하기 위해서는 해당 물질에 대한 몇 가지 일반적인 사전 정보가 필요합니다. 흑연은 탄소의 여러 동소체 중 하나입니다. 흑연은 육원형 탄소 고리가 층을 이루며 쌓인 구조로, 각 평면 내 탄소 원자는 육각형 또는 벌집 모양 격자 구조를 이룹니다. 개별 평면은 그래핀이라 불리며, 흑연은 본질적으로 그래핀 평면이 층층이 쌓인 형태입니다(그림 1).
그림 1.(왼쪽) 흑연의 단일 평면 상에 배열된 육각형 구조. (오른쪽) 흑연을 형성하는 그래핀의 적층 구조.
평면 내에서 각 탄소 원자는 인접한 세 개의 탄소 원자와 공유 결합을 형성하지만, 탄소는 결합에 사용할 수 있는 네 개의 원자가 전자를 지니고 있으므로, 남은 원자가 전자는 p-궤도에서 평면 위나 아래로 수직으로 이동한다(그림 2).
그림 2.각 탄소 원자에 존재하는 p-궤적은 sp² 혼성화로 이어진다.
평면 내 모든 탄소 원자는 p-궤도에 비국소화된 전자를 가지므로, 이 중첩은sp² 궤도 혼성화로 이어집니다. 이 과정에서 모든 비국소화된 전자는 평면 내에서 자유롭게 이동할 수 있어 pi-궤원이라 불리는 연속적인 전자 구름을 형성합니다. 이 현상은 때로 흑연의 pi-구름으로 불립니다.
층들은 약한 반데르발스 힘에 의해 결합되어 있으며, 층 배열에 따라 흑연은 2차원 또는 3차원으로 간주될 수 있습니다. 3차원 흑연은 ABAB 또는 ABCABC와 같은 규칙적인 층 배열을 가지는 반면, 2차원 흑연은 특정 배열이 없으며 적층 구조 내에서 평면들 간 간격과 정렬이 완벽하지 않습니다.2 이러한 층 간 불규칙한 배열은 흔히 터보스트라틱(turbostratic)으로 묘사됩니다. 3차원 흑연이 존재함에도 불구하고, 크로마토그래피 용도로 개발된 PGC 입자들은 모두 재료 생산 방식의 결과로 2차원 흑연입니다. 원래 "유리질(Glassy)" 탄소라는 용어는 후에 "흑연질(Graphitic)" 탄소로 변경되었는데, 이는 주목할 만하다. 일반적으로 유리질 탄소는 페놀 수지 또는 유사 수지를 극한 가열(때로는 3000°C 이상)로 열분해하여 생산되며, 이는 현재 상용화된 PGC 상과 크게 다르지 않다. 그러나 유리상 탄소는 흑연화 불가능한 물질로, 아무리 가열해도 결정질 흑연이 형성되지 않습니다. 반면 PGC는 일정 수준의 결정질 흑연을 포함합니다. PGC는 2000°C 이상의 극한 가열 조건에서 비정질 탄소 템플릿으로부터 생성됩니다. 이로 인해 탄소 원자 재배열이 발생하여 리본 형태의 흑연층이 무작위로 얽히게 됩니다.2 이러한 흑연 리본의 엮임 구조는 일반적인 흑연계 카본 블랙(GCB)과 PGC의 주요 차이점이며, PGC가 HPLC에 사용될 수 있는 내구성을 지닌 반면 GCB는 그렇지 않은 이유를 설명해 줍니다. 그림 3 a-c에 표시된 예에서 볼 수 있듯이, 확대하여 관찰할 때 PGC의 상부 표면은 완전히 평평하지 않고 노출된 흑연 리본 부분으로 구성되어 있으며, 이 리본은 결국 끝나고 동일하거나 다른 얽힌 흑연 리본의 일부인 인접한 흑연 평면에 도달합니다. 간단히 말해서, 표면은 평평한 부분과 평평한 부분이 서로 수렴하는 모서리가 있는 것으로 시각화할 수 있습니다.
그림 3a.PGC 상부 표면의 서로 다른 흑연 평면에 대한 확대 일러스트레이션.
그림 3b.PGC 입자에 견고한 강도를 부여하는 얽힌 흑연 리본들.
그림 3c.다층을 노출시킨 흑연 리본의 절단 단면.
가장자리 평면은 가장자리 탄소에 잠재적이며 채워지지 않은 원자가가 존재하기 때문에 PGC의 크로마토그래피적 거동에 역할을 할 수 있다는 가설이 제기된 바 있다. 기존 연구들은 가장자리 평면의 작용기 중요성을 경시해왔다.¹,²³ 그러나 한 연구에서는 가장자리 평면이 초기 생각보다 더 중요한 역할을 할 수 있으며, 고정상의 산화에 관여하여 유지 특성의 변화를 초래했을 가능성을 이론화하였다.4 또 다른 이론은 흑연 평면 상의 전자 분포가 극단부 또는 가장자리 근처에 국소화되는 경향이 있어 부분적으로 양전하 또는 중성 중심을 형성하고, 가장 바깥쪽 가장자리로 갈수록 음전하가 점진적으로 증가하여 분석물이 형식 전하와 같은 특성에 기반하여 흑연 표면의 특정 영역에서 상호작용하게 된다는 것이다.5,6 이 측면에서는 아직 해결되지 않은 질문들이 남아 있지만, 현재 지배적인 이론들을 보완하기 위해서는 추가적인 모델링과 특성 분석이 필요하다.
유지 특성
액체 크로마토그래피에서 PGC 표면에서 발생하는 상호작용과 분석물 유지력을 더 잘 이해하기 위해 많은 이론적 연구가 수행되었습니다. 안타깝게도 대부분의 연구는 다양한 완충액과 첨가제를 사용하는 서로 다른 이동상 설정을 활용하여 상황을 더욱 복잡하게 만듭니다. 특히 PGC와 함께 흔히 사용되는 일부 첨가제가 PGC 표면에 강하게 흡착되어 크로마토그래피적 거동을 변화시키기 때문에 이 특성은 특히 도전적입니다. 그럼에도 이러한 기초 연구들은 몇 가지 논리적 결론에 도달하는 데 기여했습니다. 지금까지 이해된 바를 간략히 요약하면, 유지력은 여러 경쟁적 요인에 의해 지배됩니다:
- 분산 상호작용 – 역상 크로마토그래피에서 관찰되는 행동과 유사하며, 이동상 강도(유기/수성 비율)와 분석물 특성에 크게 좌우됩니다.⁷⁻¹⁰
- 용매/용질 상호작용: 용액 내에서 형성되며, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 수소결합 또는 소수성-친수성 반발 상호작용일 수 있음.
- 흑연과의 용매 및 용질 분산력(런던 힘).
- 분석물의 극성화 가능한 그룹과 흑연 표면 사이의 전자적 상호작용(흔히 PREG – 흑연에 대한 극성 유지 효과(Polar Retention Effect on Graphite)로 불림).2,7,8,11
잘 이해되지는 않지만, 일종의 전하 유도 또는 흑연의 π 전자 구름과의 전자 공명 쌍 기증/수용 상호작용에서 비롯된 것으로 생각됩니다. 이 효과는 분석물의 불포화성 또는 방향족성으로 인한 π-π 중첩이 있을 경우 상당할 수 있습니다. 마찬가지로, 분석물의 입체화학 구조와 흑연 평면에 대한 극성 기능기의 위치도 중요한 역할을 합니다. - 유지는 분석물의 크기와 모양에 크게 영향을 받으며, 분석물이 흑연 표면과 접촉하는 표면적이 증가할수록 최소 표면적 접촉보다 유지 시간이 길어집니다. 이 특성은 방향족 화합물에서 특히 두드러지며(방향족 화합물에서는 π-π 중첩이 특히 중요한 것으로 보임).
소수성 분석체와의 상호작용
이론적으로 모든 탄소 원자로 구성된 표면은 매우 소수성이 강해야 하며, 긴 알킬 사슬의 역상 지지체처럼 행동해야 하지만, PGC의 경우 항상 그런 것은 아닙니다. 우리는 C18 컬럼과 PGC 컬럼 모두에서 치환된 알킬 벤젠 및 니트로알칸 계열 화합물들을 조사했습니다(그림 4 및 표 1). 일반적으로 화합물들은 유사하게 행동하지만 일부 차이점도 존재합니다.
니트로알칸
알킬벤젠
그림 4. 일련의 니트로알칸 및 알킬벤젠을 이용한 PGC와 C18의 소수성 비교. (상단) PGC 및 C18 컬럼에서 치환기의 탄소 수에 대해 플롯된 일련의 니트로알칸 및 알킬벤젠의 log(k) 데이터. (하단 좌측) PGC 및 C18 컬럼에서 얻은 log(k) 데이터의 k-k 플롯으로 강한 상관관계(R² = 0.96)를 보여줌. (하단 우측) 분석체 구조 (조건은 표 1 참조).
| 컬럼: | Ascentis® Express C18 50 x 3 mm I.D., 2.7 μm (53811-U);Supel™ Carbon LC 50 x 3 mm I.D., 2.7 µm (59991-U) |
| 이동상: | [A] 아세토니트릴; [B] 물; (알킬벤젠류의 경우 A/B 80/20, 니트로알칸류의 경우 A/B 60/40) |
| 유속: | 0.5 mL/min |
| 주입량: | 1.0 µL |
| 컬럼 온도: | 25 °C |
| 검출기: | 자외선(UV), 190 nm 및 210 nm |
| 시료: | 알킬벤젠 – 톨루엔, 에틸벤젠, 프로필벤젠, 펜틸벤젠, 각 100 μg/mL (이동상 내); 니트로알칸 – 1-니트로부탄, 1-니트로펜탄, 1-니트로헥산 각 100 μg/mL (이동상); 요소 (t0 마커) 1000 μg/mL (이동상) |
C18 컬럼과 PGC 컬럼은 유사한 성능을 보이며, k-k 플롯은 두 화합물 세트 전반에 걸쳐 이 두 상 간의 관계가 상당히 선형적임을 확인시켜 줍니다. 동족 계열 플롯은 PGC 컬럼이 C18 컬럼에 비해 각 메틸렌 첨가 위치에 대해 더 선택적임을 나타내는 약간 가파른 기울기를 보입니다. 흥미롭게도, 알킬벤젠의 경우 C1(톨루엔)에서 C2(에틸벤젠)로의 메틸렌 첨가는 나머지 데이터 세트와 동일한 기울기 패턴을 따르지 않습니다. 이러한 결과의 원인은 톨루엔의 방향족 구조와 에틸벤젠이 자유 회전을 가지며 고정상 표면과 접촉할 수 있는 분자 표면적 일부를 상실한다는 사실과 관련이 있을 수 있습니다.
친수성 분석물과의 상호작용
PGC는 C18과 같은 표준 역상 컬럼에서는 일반적으로 유지되지 않는 극성, 친수성 분석물을 더 잘 유지하는 능력으로 알려져 있습니다. 그러나 어떤 유형의 화합물이 유지되고 유지되지 않는지에 대해서는 혼란이 있습니다. 우리는 두 세트의 극성 분석물을 조사했습니다.
그림 5의 크로마토그래피 결과(조건은 표 2 참조)에서 볼 수 있듯이, C18 컬럼은 아세톤만 유지할 수 있습니다. 그러나 PGC 컬럼에서는 두 번째 세트의 모든 분석물이 유지되고, 첫 번째 세트에서는 아세톤만 약간 유지됩니다. C18 컬럼이 이러한 분석물을 유지하지 못하는 것은 당연합니다. 이 화합물들은 음의 log P 값을 가진 매우 친수성 물질이며, 옥타데실 리간드의 상호작용은 이 극성 분석물질들이 주 이동상(90% 물 / 10% 아세토니트릴)과 형성하는 더 강한 쌍극자-쌍극자 상호작용을 깨뜨릴 만큼 충분히 강하지 않습니다. 따라서 분석물질들은 용액에 남아 있으며 유지가 관찰되지 않습니다.
그림 5. (상단) 세트 1 및 2 분석물 구조, (중간) C18 컬럼에서의 세트 1 및 2 크로마토그램, (하단) PGC 컬럼에서의 세트 1 및 2 크로마토그램. 이 경우 C18 컬럼은 아세톤을 제외한 어떤 분석물도 유지하지 못합니다. 반대로 PGC 컬럼은 세트 2의 시토신과 우라실을 유지할 수 있으나, 세트 1 분석물에 대해서는 C18과 유사하게 유지가 전혀 되지 않거나 불량한 유지가 관찰됩니다( 조건은 표 2참조).
| 컬럼: | Ascentis® Express C18 50 x 3 mm I.D., 2.7 μm (53811-U);Supel™ Carbon LC 50 x 3 mm I.D., 2.7 µm (59991-U) |
| 이동상: | [A] 아세토니트릴; [B] 물; (10/90 A/B) |
| 유속: | 0.5 mL/min |
| 주입량: | 1.0 µL |
| 컬럼 온도: | 25 °C |
| 검출기: | 자외선(UV), 190 nm 및 210 nm |
| 시료: | 세트 1 – 요소, 아세트아미드, 아세톤, 각각 100 μg/mL 용매상; 세트 2 – 요소, 디하이드로우라실, 시토신, 우라실, 각각 100 μg/mL 용매상 |
분석물질과 PGC 컬럼 간의 상호작용은 완전히 다릅니다. 첫 번째 세트의 경우, 작은 극성 분석물질에 대해 C18 상과 유사하게 유지력이 낮은 것으로 관찰됩니다. 세 분석물질 모두 평면 구조를 가지며, 카르보닐 그룹으로 인해 π 전자를 보유하고, 불균일한 전하 분포를 보입니다. 이는 PGC에서의 유지에 적합한 분석물 특성입니다. 그러나 매우 작은 극성 분자의 경우, 불균일한 전하 분포가 흑연 표면을 유도하지 못하거나, 용매가 용질을 용액 상태로 유지하려는 성질에 의해 그 기여도가 감지되지 않는 것으로 보입니다. 또한 작은 극성 분자는 훨씬 큰 극성 분자에 비해 흑연 평면과 상호작용할 분자 표면적이 충분하지 않습니다. 이를 유지될 수 있는 두 가지 극성 고리형 화합물과 대비해 보십시오. 우라실은 역상 크로마토그래피에서 흔한t0 마커이지만, PGC 기반 재료에서는 그대로 사용할 수 없습니다. 우라실보다 훨씬 친수성이 높은 시토신도 유지됩니다. 용출 순서에 관한 가장 설득력 있는 세부 사항은 디하이드로우라실이 우라실보다 현저히 일찍 용출된다는 점입니다.
분석물의 입체화학 구조의 중요성
수년간 PGC가 화합물의 입체화학에 기반한 독특한 형태 선택성을 보인다는 사실은 잘 입증되어 왔다. 앞서 제시된 일부 정성적 사례들조차도 이 현상의 일부 측면을 엿볼 수 있다. 알킬벤젠 계열의 기울기가 톨루엔을 데이터 세트에서 제거했을 때 선형성이 개선된 이유는 무엇인가? 마찬가지로, 왜 디하이드로우라실은 현저히 낮은 유지율을 보이는가? 후자의 경우를 살펴보면, 우라실은 완전히 평면 구조를 가지지만 고리에서 이중 결합을 잃음으로써 분자는 어느 정도의 자유 회전을 가져야 하며, 디하이드로우라실은 약간 휘어져 있다. 결과적으로 디하이드로우라실은 비평면 구조이므로 우라실에 비해 흑연 평면에 접촉할 수 있는 표면적이 줄어듭니다(그림 6). 이 측면은 PGC를 고정상으로 사용할 때 반드시 고려해야 할 중요한 요소입니다. 분석물의 입체화학은 PGC가 유사한 화합물을 유지하거나 유지하지 못하거나 구별하는 결정적 요인이기 때문입니다.
그림 6.분석물의 형태가 PGC의 흑연 표면에서 발생하는 최대 분자 표면적 접촉량에 미치는 영향을 보여주는 그림. 왼쪽 화합물이 오른쪽 화합물보다 더 큰 그림자를 드리우고 있음을 주목하십시오. 이는 더 많은 표면적 상호작용과 고정상과의 더 강한 상호작용을 나타냅니다.
결론
다공성 흑연 탄소(PGC)는 독특한 고정상으로, 크로마토그래퍼에게 기존 역상 크로마토그래피의 범위를 넘어서는 까다로운 화합물을 분리할 수 있는 추가적인 화학적 옵션을 제공합니다. 여러 측면에서 PGC 컬럼은 향상된 온도 및 pH 안정성을 지닌 역상 컬럼처럼 작동할 수 있지만, 흑연의 특수한 특성 덕분에 HILIC 또는 이온 교환 조건이 필요할 수 있는 극성 화합물도 유지될 수 있습니다. 그러나 충분한 유지력을 확보하기 위해서는 분석물의 입체화학 및 잠재적 표면적 접촉점에 대한 고려가 필요합니다. 특히 PREG(Precipitation-Enhanced Retention of Graphite)와 관련된 메커니즘은 완전히 이해되지 않았지만, PGC가 극성 화합물, 특히 흑연의 전자 구름과 상호작용할 수 있는 평면 분자 또는 이중 결합 공명 구조를 가진 분석물에 대해 독특한 유지 특성을 지닌다는 점은 부인할 수 없습니다. 이러한 근본적 메커니즘에 대한 추가 연구는 보다 정확한 유지 예측 모델을 도출할 것입니다.
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참고문헌
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