[콘텐츠로 건너뛰기](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko) 제품 장바구니0 KRKO 제품 [로그인 / 등록](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [주문 조회](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/order-lookup) [빠른 주문](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/quick-order) 장바구니0 [Home](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko)[Solid Phase Microextraction (SPME)](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/applications/analytical-chemistry/sample-preparation/solid-phase-microextraction)생물학적 SPME를 이용한 시료 청정도 분석 # 생물학적 SPME를 이용한 시료 청정도 분석 __M. James Ross, Senior R&D Scientist, Olga Shimelis, R&D Manager__ Merck - [인산지질 제거 효율: 생체표면상스왑미세전극(BioSPME) 대 아세토니트릴 단백질 침전법](https://www.sigmaaldrich.com#phospholipids-removal) - [혈장 내 알부민 단백질 제거](https://www.sigmaaldrich.com#albumin-protein-removal) - [LC-MS/MS를 통한 전체 시료 청정도 측정](https://www.sigmaaldrich.com#cleanliness) - [결과 및 논의: Supel™ BioSPME 96-PIN 장치가 아세토니트릴 기반 시료 전처리보다 우수한 성능을 보임](https://www.sigmaaldrich.com#results-discussion) - [결론: BioSPME를 통한 효과적인 시료 전처리](https://www.sigmaaldrich.com#conclusion) [제품 보기](https://www.sigmaaldrich.com#materials) 시료 전처리는 분석을 위한 시료 준비 및 매트릭스 효과를 제거하기 위해 수행된다. 매트릭스 효과는 분석 대상 물질의 신호를 방해할 수 있는 내인성 물질에 의해 발생한다.¹ 매트릭스 효과에 민감한 분석법 중 하나는 LC-MS/MS이다. 혈장은 단백질, 지질, 염류 및 탄수화물을 포함하는 복잡한 매트릭스로, 일정한 시료 전처리가 필요하다. 이러한 문제점을 해결하지 못하면 잠재적인 매트릭스 효과뿐만 아니라 분석 시간 증가, 새 컬럼 투자, 또는 기기 유지보수 시간 증가로 이어질 수 있습니다. 본 연구에서는 LC-MS/MS 분석을 위한 시료 전처리에서 고체상 미세 추출법(SPME)과 [Supel™ BioSPME](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/solid-phase-microextraction/supel-biospme-96-pin-devices) C18 96-핀 도구의 효과성을 보고합니다. 이전 연구에서는 단백질 결합 값 측정용 시료 전처리에서 BioSPME의 능력을 입증한 바 있습니다.2 ## [](https://www.sigmaaldrich.com)인산지질 제거 효율: BioSPME 대 아세토니트릴 단백질 침전법 BioSPME 96핀 툴(__그림 1__)을 이용한 추출 후 시료에 잔류하는 인지질 양을 아세토니트릴 보조 단백질 침전 후 잔류 인지질 양과 비교하였다. BioSPME 절차는 __그림 2에 개략적으로__ 설명되어 있다. 간단히 말해, 핀 도구는 이소프로판올에서 컨디셔닝한 후 물로 간단히 헹군다. 이 시점에서 핀 도구는 추출 준비가 완료된다. 추출 후, 핀 도구는 분석 대상 물질이 탈착되기 전에 핀 표면에 남아 있을 수 있는 단백질을 제거하기 위해 간단히 헹군다. 이후 분석 준비가 완료된다. 단백질 침전은 100µL의 인간 혈장과 300µL의 아세토니트릴을 혼합하여 수행하였다. 혼합물은 4°C에서 20분간 보관한 후 5,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 옮겨 10psi 질소 기류 하에서 45°C에서 건조시켰습니다. 이후 시료를 초기 이동상 200µL에 재현탁시켰습니다. [](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/solid-phase-microextraction/supel-biospme-96-pin-devices) __그림 1.__Supel™ BioSPME C18 96핀 도구 모습. | | | | | | | | | | | | |----|------|----|------|----|------|----|------|----|------|----| | 조건 | > | 세탁 | > | 추출 | > | 세척 | > | 탈착 | > | 분석 | 그림 2.생물학적 SPME(BioSPME) 단계 개요 두 가지 방법으로 채취한 다섯 개의 시료를 AB Sciex-3200 Q Trap 질량 분석기와 Agilent 1290 LC를 사용하여 __표 1에__ 기술된 방법으로 분석하였다. 모니터링한 인지질은 __표 2에__ 기재되어 있다. 컬럼:Ascentis® Express C8 컬럼, 10 cm x 2.1 mm, 2.7 µm ([53832-U](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/product/supelco/53832u)) 이동상:\[A] 5 mM 암모늄 아세테이트, 0.1% 아세트산 수용액 \[B] 5 mM 암모늄 아세테이트, 0.1% 아세트산 용액 (95% 아세토니트릴 및 5% 물) 그라디언트:80% A, 20% B 상태로 1.5분 유지; 1.5분 동안 100% B로 증가; 0.1분 동안 유속을 0.6 mL/min으로 증가시키고 100% B 상태로 12분 유지; 0.1분 동안 유속을 0.4 mL/min으로 감소시키고 20% B 상태로 3분 유지. 유속:0.4~0.6 mL/min (그라디언트 참조) 컬럼 온도:40 °C 검출기:MS, ESI(+) 예약된 MRM ( __표 1__ 및 __2__ 참조) 주입량:2 또는 5 µL 표 1.인산지질 모니터링을 위한 LC-MS/MS 조건 | | | | | | | |----------|-------|-------|------------|-----|----| | 분석물 | 전구체 | 생성물 | 체류 시간 (ms) | DP | CE | | 콜린 | 184.1 | 104.1 | 40 | 120 | 80 | | LPC 16:0 | 496.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | LPC 18:0 | 524.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | PC 30:1 | 704.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | PC 34:2 | 758.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | PC 36:2 | 786.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | PC 38:6 | 806.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | LPC 18:2 | 520.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | LPC 18:1 | 522.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | PC 36:1 | 788.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | PC 38:5 | 804.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | PC 34:1 | 760.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | | PC 36:3 | 784.4 | 184.1 | 40 | 120 | 80 | 표 2.모니터링된 인지지질 (LPC – 리소포스파티딜콜린; PC – 포스파티딜콜린) ## [](https://www.sigmaaldrich.com)혈장으로부터 알부민 단백질 제거 핀에 비특이적으로 잔류한 단백질의 양은 NanoOrange™ 키트를 사용하여 측정하였다. 핀(8개)은 정적 조건 하에서 웰 플레이트에 800 µL의 이소프로판올 용액에 20분간 처리하였다. 이후 핀을 800 µL의 물로 10초간 세척하였다. 풀링된 인간 혈장(800 µL) 추출은 96-웰 플레이트에서 1200 rpm, 3 mm 궤도 반경으로 교반하며, 써모 어댑터를 37 °C로 설정하여 수행했다. 추출 후 핀들은 물로 1분간 세척했다. 제품 설명서에 명시된 대로 작업용 용액(단백질 염색용 염료) 1mL를 웰 플레이트의 해당 웰에 주입하여 다른 웰 플레이트를 준비했습니다. 소 혈청 알부민(BSA) 추출에 사용된 핀을 작업용 용액에 노출시킨 후 300rpm으로 교반하면서 90-96°C에서 10분간 반응시켰습니다. 웰 플레이트는 시료를 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 덮었습니다. 그런 다음 시료를 실온으로 냉각시켰습니다. 샘플은 Thermo Scientific Dionex HPLC 기기에서 형광 검출기를 사용한 직접 유동(컬럼 없음) 방식으로 분석되었으며, 자세한 내용은 __표 3을__ 참조하십시오. 샘플은 0.1–5.0 µg/mL 범위의 BSA에 대한 외부 교정을 사용하여 피크 높이로 정량화되었습니다. | | | |------|---------------------| | 컬럼: | 없음 (직접 주입) | | 이동상: | 물, 100% | | 유속: | 1 mL/min | | 온도: | 시료 5 °C, 유동 셀 30 °C | | 검출기: | 형광, 485/590 nm | | 주입량: | 50 µL | 표 3.표지된 단백질의 형광 신호를 모니터링하기 위한 LC-형광 조건. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)LC-MS/MS를 이용한 전체 시료 청정도 측정 시료의 청정도 측정은 다음 세 가지 조건에 대해 총 이온 크로마토그램(TIC)을 측정하여 결정하였다: 80:20 탈착 용액(메탄올:물, 부피비) 대조군, BioSPME로 추출한 첨가 혈장 시료, 아세토니트릴 보조 단백질 침전 혈청 시료. 아세토니트릴 보조 단백질 침전 시료는 다음과 같이 준비하였다. 추출 시료에 사용된 혈장과 동일한 양의 첨가 혈장 시료를 아세토니트릴(v/v)로 3배 희석하였다. 이 시료를 4°C에서 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 이 후 상층액을 제거하고 질소 하에서 10psi로 건조시킨 후, 용매 효과를 최소화하고 시료 청정도를 더 잘 반영하기 위해 탈착 용액에 재현탁시켰다. 세 가지 시료 모두 __표 1에__ 기술된 대로 2µL 주입량과 100~900 m/z 범위의 Q1 스캔을 사용하여 분석하였다 __.__ 관심 시료마다 메탄올을 여러 번 주입하여 시료 간 잔류물 이송을 제거하였다. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)결과 및 논의: Supel™ BioSPME 96-PIN 장치가 아세토니트릴 기반 시료 전처리보다 우수한 성능을 보임 BioSPME로 준비된 시료의 인지질 함량을 아세토니트릴 보조 단백질 침전법으로 준비된 시료와 비교하였다. __표 4에서__ 볼 수 있듯이, BioSPME를 사용한 최종 추출 시료에는 아세토니트릴 보조 단백질 침전 대조군에 비해 0.1% 미만의 인지질이 잔류하였다. 두 조건을 비교한 시료 크로마토그램은 __그림 3에__ 제시되어 있다. | | | | | |--------|------|-------------|----------| | 방법 | 시료 수 | 평균 잔류 인지질 % | 표준 편차 | | 생체SPME | 5 | <0.1 | <0.01 | 표 4.분석법에 의해 분석물에 잔류하는 인지질.  __그림 3.__대조군 시료(아세토니트릴 단백질 침전, 보라색)와 BioSPME 시료(녹색)의 인지질에 대한 대표 크로마토그램(2 µL 주입). 나노오렌지™(NanoOrange™) 연구에 따르면, 핀 도구는 핀 표면에 약 1.2 µg의 단백질(BSA 대비 정량)을 축적했습니다. 교정용 핀과 비교한 핀의 대표 크로마토그램은 __그림 4에서__ 확인할 수 있습니다. 알부민은 혈장 내 총 단백질의 절반 이상(35mg/mL~50mg/mL)을 차지합니다.³ 이 값은 테스트된 8개의 핀에 걸쳐 __표 5에__ 표시된 바와 같이 최종 추출 샘플 내 단백질의 0.01% 미만에 해당합니다. | | | | | | |-------------------------------|------|------|------|--------------------| | \# 샘플 수 | 시료 수 | 양 µg | 표준편차 | 혈장으로부터 유지된 단백질 비율a | | 핀 | 8 | 1.2 | 24 | <0.01% | | a혈장 내 알부민 농도 35,000 µg/mL 기준2 | | | | | 표 5.핀 도구에서 추출한 단백질 요약  __그림 4.__알부민 단백질, 추출 핀(파란색), 및 2.5 µg/mL 표준(검정색)의 대표 크로마토그램. 표준 시료 대비 더 깨끗한 시료를 입증하기 위해, 단백질 침전 혈장 시료, BioSPME 추출 혈장 시료 및 탈착 용액에 대해 전체 TIC를 수집하였다( __그림 5__ 참조 __)__. 보여지듯이, BioSPME 추출 시료는 아세토니트릴 침전 시료보다 탈착 용액에 훨씬 더 가깝습니다. 탈착 용액에서 관찰되는 피크는 존재하는 중수소 표지 카르바마제핀(RT ~4.5분)에 해당합니다.  __그림 5.__단백질 침전 시료(녹색), BioSPME 추출 시료(분홍색), 탈착 용액(파란색) 내 인지질의 TIC 크로마토그램(5 µL 주입). 크로마토그램은 동일한 상대 카운트로 조정되었습니다. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)결론: BioSPME를 통한 효과적인 시료 전처리 이 [BioSPME 96핀 도구는](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/solid-phase-microextraction/supel-biospme-96-pin-devices) 인간 혈장 분석을 위해 최소한의 매트릭스 효과를 가진 깨끗한 시료를 신속하고 효율적으로 전달하는 방법을 제공합니다. ## 재료 예기치 못한 오류가 발생했습니다. Response not successful: Received status code 500 ### 참고문헌 1\. Fang N, Yu S, Ronis MJ, Badger TM. 2015. Matrix effects break the LC behavior rule for analytes in LC-MS/MS analysis of biological samples. Exp Biol Med (Maywood). 240(4):488-497. [https://doi.org/10.1177/1535370214554545](https://doi.org/10.1177/1535370214554545) 2\. Roy KS, Nazdrajić E, Shimelis OI, Ross MJ, Chen Y, Cramer H, Pawliszyn J. 2021. Optimizing a High-Throughput Solid-Phase Microextraction System to Determine the Plasma Protein Binding of Drugs in Human Plasma. Anal. Chem.. 93(32):11061-11065. [https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c01986](https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c01986) 3\. Merlot AM, Kalinowski DS, Richardson DR. Unraveling the mysteries of serum albuminâ—more than just a serum protein. Front. Physiol. 5 [https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00299](https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00299) __관련 기사__ - [Supel™ BioSPME 96-핀 장치](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/solid-phase-microextraction/supel-biospme-96-pin-devices) - [Protein Binding Determination - Comparison Study of Techniques & Devices](https://www.sigmaaldrich.com/KR/en/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/solid-phase-microextraction/protein-binding-determination-comparison-study-of-techniques-devices) - [BioSPME for Plasma Protein Binding Assay: Details of Method Development and Optimization](https://www.sigmaaldrich.com/KR/en/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/solid-phase-microextraction/biospme-plasma-protein-binding-assay) - [Protein Binding Determination Using Supel™ BioSPME C18 Pin Device as Part of the Manual Methodology With and Without Shaking](https://www.sigmaaldrich.com/KR/en/technical-documents/technical-article/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing/small-molecules-analysis-quality-control/protein-binding-determination-using-supel-biospme-c18-pin-device) __관련 제품 카테고리__ - [고체미량추출법(SPME)](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/products/analytical-chemistry/analytical-sample-preparation/spme-fibers-and-accessories) - [HPLC 컬럼](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/products/analytical-chemistry/analytical-chromatography/hplc-columns) - [HPLC 버퍼](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/products/analytical-chemistry/analytical-chromatography/hplc-buffers) - [용제](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/products/analytical-chemistry/analytical-chromatography/solvents) - [크로마토그래피 및 분광학 시약](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/products/analytical-chemistry/analytical-reagents/chromatography-spectroscopy-reagents) - [생물학적 버퍼](https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/products/chemistry-and-biochemicals/biochemicals/biological-buffers) 상부 __계속하려면 로그인하세요.__ 계속 읽으시려면 로그인하거나 계정을 생성하세요. 로그인__계정이 없으십니까?__등록 이 페이지는 고객의 편의를 위해 기계로 번역하였습니다. 정확한 번역을 제공하고자 노력하였으나 기계 번역은 완벽하지 않을 수 있습니다. 기계 번역된 내용에 만족하지 않으실 경우 영어 원문을 참고하시기 바랍니다. An unknown error has occured. - 한국어 - KO - English - EN [자세히 보기](https://www.sigmaaldrich.com)