FFPE 조직 및 기타 손상된 DNA 원천으로부터의 DNA 품질 평가를 위한 정성적 다중 PCR 분석법
DNA 품질 평가는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 및 기타 손상된 DNA 원천으로부터 의미 있는 데이터를 획득하는 데 있어 중요한 첫 단계입니다. 완전한 게놈 DNA를 사용하는 것은 염색체 이상 분석(예: SNP 분석, LOH, aCGH 등)의 성공적 수행에 핵심적입니다. FFPE 조직은 염색체 이상 분자 특성화용 DNA 원천으로 점점 더 많이 사용되고 있으나, 포르말린이 핵산과 반응하여 돌이킬 수 없는 손상을 일으켜 하류 공정에서 작동하지 않을 수 있는 저품질 DNA 샘플을 생성한다는 것은 잘 알려져 있습니다.1,2 이러한 샘플 컬렉션 내 DNA 손상에 기여하는 요인은 고정 조건과 샘플의 연령 등 여러 가지가 있습니다. 결과적으로 시료마다 손상 정도를 판단하기 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 머크는 aCGH와 같은 번거롭고 비용이 많이 드는 하류 공정 수행 전에 DNA 품질을 판단할 수 있는 간단하고 정성적인 겔 기반 다중 PCR 분석법을 개발했습니다. 점차 증가하는 크기의 단편을 증폭하는 프라이머 세트를 사용한 다중 PCR은 지나치게 손상된 시료를 식별하는 효과적인 품질 관리 도구로 입증되었습니다. 더 큰 PCR 산물을 증폭할 수 있는 능력은 WGA를 포함한 성공적인 분자 조작이 가능한 고품질 DNA를 예측하는 지표가 됩니다.3,4
재료 및 방법
DNA 분해 예측을 위한 겔 기반 다중 PCR 분석법 프로토콜은 아래와 같다. 이 분석법은 NCBI UniSTS 데이터베이스에서 도출된 5개의 프라이머 세트로 구성되며, 132bp에서 295bp 범위의 증폭 산물을 생성한다(표 1).
NCBI UniSTS 데이터베이스
DNA 샘플 품질이 저하되면 이들 제품 중 일부 또는 전부가 증폭에 실패하게 되며, 이로 인해 증폭된 단편의 수와 크기를 기반으로 게놈 DNA 품질을 분류할 수 있습니다. 고품질 게놈 DNA는 다섯 개의 증폭 산물을 모두 생성합니다. 이 분석법은 사전 검증 작업 없이는 손상된 DNA의 유용성을 예측할 수 없습니다. 예를 들어, 샘플이 aCGH 수행에는 너무 파편화되었을 수 있지만, qPCR 기반 SNP 분석에는 여전히 유용할 수 있습니다. 상관 실험을 수행하여 경험적으로 품질 기준점을 결정함으로써 하류 실험의 재현성을 보장할 수 있습니다. 예를 들어, 일부 응용 분야에서는 성공적인 결과를 예측하기 위해 다섯 가지 증폭 산물이 모두 생성되어야 할 수 있는 반면, qPCR과 같은 다른 분야에서는 단일 밴드의 존재만으로도 충분할 수 있습니다(그림 1). 이러한 방식으로 서로 다른 출처의 샘플을 비교할 수 있으며 실험의 재현성이 보장됩니다.
그림 1.5개의 FFPE 조직 샘플에서 약 1mg의 조직을 채취한 후, 기술 자료에 명시된 대로 GenomePlex Tissue Whole Genome Amplification Kit(제품 번호 WGA2)를 사용하여 처리하였습니다. (A) 희석하지 않은 WGA2 조직 용해액 5μL를 아래 설명된 대로 다중 PCR 증폭에 적용한 후, 각 반응액 5μL를 4% 아가로즈 겔(Invitrogen # G6000-04)에 분리했습니다. 크기 표준으로 100bp DNA 래더(Invitrogen 카탈로그 # 15628-019)를 사용했습니다. 레인 1과 2에서는 5개 밴드가 모두 증폭되어 이 FFPE 조직 용해액이 고품질 게놈 DNA를 함유함을 나타낸 반면, 레인 3, 4, 5에서는 다중 PCR 단편의 전부 또는 대부분이 증폭되지 않아 저품질 DNA를 함유함을 나타냈다. 정제된 DNA 또는 이 FFPE 조직에서 유래한 증폭된 WGA 산물을 다중 qPCR 분석에 직접 사용했을 때도 유사한 결과가 관찰되었다(데이터 생략). (B) 다중 PCR 결과와 aCGH 성능 간의 상관관계를 입증하기 위해 aCGH를 수행하였다. 제조업체 권장사항에 따라 머크의 Spectral Labeling Kit 및 SpectralChip™ 2600 어레이 플랫폼을 사용하여 BAC aCGH 분석을 위해 WGA2 산물 1μg을 사용하였다. 아래 이데오그램은 이 샘플 세트로 얻은 데이터를 대표합니다. 이들은 머크의 Spectralware™ BAC 어레이 분석 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다. 샘플 1과 2에서는 고품질의 어레이 통계 및 QC 지표를 얻었으나, 샘플 3, 4, 5에서는 불규칙한 어레이 통계와 열악한 QC 지표가 나타났습니다. 시험 및 대조군 하이브리다이제이션 샘플은 그림 B에 표시되어 있습니다.
손상된 DNA(예: FFPE 조직 DNA) 평가를 위한 다중 PCR 프로토콜
이 과정에는 JumpStart™ REDTaq™ ReadyMix™ PCR 반응 혼합액 사용을 권장합니다. 소량 PCR 반응을 수행할 경우 시약을 비례적으로 조정할 수 있습니다.
1. 모든 10종의 프라이머를 적절한 용기에 혼합하여 최종 농도 10μM의 멀티플렉스 프라이머 혼합액을 준비합니다. 프라이머 서열은 표 1을 참조하십시오.
2. 아래 표 2에 따라 적절한 크기의 튜브에 다음 반응 성분을 혼합합니다. 수행하는 반응 수에 맞게 마스터 믹스를 적절히 증량하십시오. 피펫팅 손실을 고려하여 여분의 마스터 믹스를 준비하십시오. 참고: 시약 농도가 변하지 않는 한 최종 PCR 반응 용량은 증량 또는 감량할 수 있습니다.
3. 생성된 마스터 믹스 45 μL를 적절한 PCR 튜브 또는 플레이트에 첨가합니다.
4. 게놈 DNA 5 μL를 첨가하고 균일해질 때까지 혼합합니다. 최적의 결과를 위해 반응당 10~100 ng의 템플릿 DNA를 사용하십시오. 참고: 정제된 게놈 DNA 대신, 희석하지 않은 GenomePlex WGA2 조직 용해액 5μL 또는 머크 GenomePlex 제품으로 생성된 WGA 증폭산물 100ng을 대신 첨가할 수 있습니다.
5. PCR 튜브 또는 플레이트를 열순환기에 넣고 다음 순환 조건으로 DNA를 증폭합니다.
- 94 °C에서 2분간 변성
- 35회 반복:
- 94 °C 1분
- 60 °C 1분
- 72 °C 1분
- 72 °C에서 7분간 유지
- 4 °C 유지
생성된 증폭 산물 5μL를 4% 아가로즈 겔에 분리합니다. 참고: JumpStart RedTaq ReadyMix에는 겔 로딩 용액이 포함되어 있어 PCR 후 즉시 아가로즈 겔에 시료를 로딩할 수 있습니다. 고품질 게놈 DNA를 사용하면 다섯 가지 PCR 증폭 산물(132 bp, 150 bp, 196 bp, 235 bp 및 295 bp)이 모두 생성됩니다. 저품질 DNA는 증폭 산물을 생성하지 못하거나 일부 증폭 산물이 희미한 밴드로 나타날 수 있습니다(그림 1).
결론
결론적으로, 본 연구에서 제시된 분석법은 손상 가능성이 있는 시료(예: FFPE 조직, 혈청/혈장, 법의학적 시료 등)의 DNA 품질을 판단하는 데 유용하다. 비록 DNA 품질 평가에는 유용하지만, 정량적 정보를 제공하지는 못한다. 이러한 경우, 손상된 샘플의 DNA 농도를 측정하기 위한 실행 가능한 대안으로 qPCR이 있습니다. 5,6 본 분석법은 사전 검증 작업 없이 손상된 DNA의 유용성을 예측할 수 없습니다. 오히려, 선택한 하류 응용 분야에 대해 경험적으로 품질 기준점을 결정하기 위해 상관 실험을 수행해야 합니다.