mRNA 백신 및 치료제 제조 전략
개발부터 임상 단계까지의 기간이 단축된 mRNA 기술은 감염병 발생에 신속하고 효과적으로 대응할 수 있는 수단일 뿐만 아니라, 미충족 의료 수요가 있는 질환을 치료할 새로운 치료제를 개발하는 데 있어서도 유망한 기술을 제시합니다. mRNA 기술은 뛰어난 안전성, 높은 유연성, 그리고 템플릿 기반 제조 공정 등 다양한 이점을 제공합니다.
mRNA 백신의 초기 성공에 힘입어, 오늘날의 mRNA 제조사들은 mRNA의 안정성을 높이고, pDNA 및 mRNA 정제 효율을 개선하며, GMP 생산 규모로 확대하는 전략을 도입함으로써 생산 공정의 효율성과 생산성을 향상시키기 위해 노력하고 있습니다.
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섹션 개요
mRNA 제조 시 고려 사항
mRNA 백신 및 치료제의 제조는 일반적으로 표준화된 공정을 따릅니다(그림 1). 이 단순화된 제조 템플릿은 모든 표적에 대해 동일한 반응 물질을 사용하므로, mRNA 제조업체는 공정을 최소한으로 수정하는 것만으로 새로운 표적 분자를 생산할 수 있습니다.
그림 1.mRNA 제조의 전반적인 공정 개요.
몇 가지 핵심적인 결정 사항이 공정, 수율 및 최종 mRNA 제품의 품질에 막대한 영향을 미치는데, 그중 하나가 바로 공정용 화학물질과 원료의 품질입니다. 특히 체외 전사 및 후속 정제 단계에서 mRNA는 보호되지 않은 상태로 노출되어 효소적 분해 위험이 매우 높습니다. 엔도뉴클레아제 활성이 없음이 검증된 고품질 화학물질을 사용하면 RNase에 의한 분해 위험을 최소화하고, mRNA 의약품의 정제 및 제형화 전 과정에 걸쳐 mRNA의 안정성을 향상시킬 수 있습니다.
이 웹페이지는 귀사의 mRNA 제조 공정을 효율화하기 위해 설계된 머크의 포괄적이고 통합된 솔루션에 대한 정보를 제공함으로써, 이러한 과제와 기타 문제들을 해결하는 데 도움을 드릴 것입니다. 머크의 브로셔 "mRNA 의약품 제조용 공정 화학물질"은 귀사가 정보에 입각한 선택을 내리는 데 필요한 세부 정보를 제공합니다.
그림 2.mRNA 구조.
- 서열의 5’ 말단에 위치한 캡 영역: mRNA 성숙, 효율적인 단백질 번역을 위한 리보솜의 인식, 그리고 안정성 향상을 위한 뉴클레아제 분해로부터의 보호에 필수적이다.
- mRNA 코딩 영역의 상류 및 하류 도메인에 위치한 비번역 영역(UTR): mRNA의 번역, 국소화 및 안정성을 조절하며, 단백질 발현 효율을 높이는 데 활용될 수 있습니다.
- 개방 독판(open reading frame) 또는 코딩 서열 영역: 관심 유전자(GOI)를 포함합니다.
- 폴리(A) 꼬리: 3’ 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 방지하여 단백질 번역 및 mRNA 안정성에 결정적인 역할을 합니다.
mRNA 제조
mRNA 기반 치료제 및 백신의 생산은 플라스미드 DNA(pDNA) 템플릿을 사용하여 시작되며, 이 템플릿은 선형화된 후 mRNA로 전사됩니다.
- pDNA 생산: pDNA 템플릿에는 DNA 의존성 RNA 중합효소 프로모터와 mRNA 구축체의 서열이 포함되어 있습니다. pDNA는 세균 세포 내에서 증폭된 후, 세포를 수확하여 용해시켜 원형 pDNA를 방출합니다. 이 용해액은 pDNA와 RNA, 게놈 DNA, 세균 세포 유래 내독소와 같은 음전하를 띤 대형 불순물을 포함하고 있어 점도가 매우 높으며, 이로 인해 정제가 어렵습니다.
- pDNA 정제: 불순물로부터 pDNA 템플릿을 정제할 때는 플라스미드 템플릿에 대한 기계적 손상의 가능성을 최소화하면서 분리 효율을 극대화해야 한다. 정제된 원형 pDNA는 이후 전사 리드스루 현상을 방지하기 위해 선형화됩니다. 전사 리드스루는 제거해야 할 원치 않는 mRNA 서열 변이체를 생성할 수 있기 때문입니다.1 이렇게 선형화된 pDNA 템플릿은 선형화에 사용된 제한 효소, 소 혈청 알부민(BSA), DNA 단편 및 내독소와 같은 불순물을 제거하기 위해 추가 정제 과정을 거칩니다. pDNA 템플릿은 일반적으로 박테리아 세포에서 생산되므로, 내독소 불순물은 후속 정제 단계에 영향을 미치는 중요한 불순물입니다. Deviron® C16 세제와 같은 세제는 내독소를 효과적으로 제거하는 데 사용할 수 있으며, 기존 세제에 비해 지속 가능하고 생분해되며 REACH 규정을 준수하는 대안입니다.2
실험실 규모와 GMP 생산 규모에서 pDNA 정제 방식에는 뚜렷한 차이가 있습니다. 실험실 규모 공정에서는 종종 용매 추출 기술을 사용하여 pDNA를 다른 성분으로부터 분리하지만, 대규모에서 이러한 화학 물질을 취급하고 폐기하는 것은 어려울 수 있습니다. 반면, GMP 생산 환경에서는 일반적으로 횡류 여과(TFF)와 크로마토그래피를 사용하여 불순물을 효율적으로 제거합니다.
체외 전사(IVT): 선형화되고 정제된 pDNA는 이후 효소 반응을 통해 mRNA로 전사됩니다.
- 체외 전사에 필수적인 구성 요소로는 DNA를 mRNA로 전사하는 반응을 촉매하는 RNA 중합효소, mRNA의 구성 단위로 작용하는 리보뉴클레오시드 삼인산(rNTP), mRNA 수율을 높이는 무기 피로인산분해효소(IPP), 그리고 RNA 분해를 방지하는 RNase 억제제가 있습니다. 전사 완충액에는 일반적으로 디설파이드 결합을 환원하고 RNase 활성을 억제하는 디티오트레이톨(DTT)이 포함되며, 전사 효율을 높이고 핵산을 안정화하기 위해 스퍼미딘이 포함됩니다. 이 중요한 공정 단계에서 효소적 분해의 위험을 최소화하기 위해서는 엔도뉴클레아제 활성이 없음이 검증된 화학 물질을 선택하는 것이 필수적입니다. 엔도뉴클레아제가 없는 광범위한 제품군을 포함한 머크의 고품질 화학물질 및 부형제에 대한 포괄적인 개요를 확인하시려면 브로셔 “mRNA 의약품 제조용 공정 화학물질”을 참조하십시오.
- 전사 모니터링: IVT 반응 중에는 핵심 공정 매개변수(CPP)를 모니터링하여 핵심 품질 속성(CQA)을 관리하고 최적의 공정 진행을 보장해야 합니다. 효과적인 모니터링을 통해 제조 공정을 보다 정밀하게 제어하고 공정 변동성에 더 신속하게 대응할 수 있습니다.
캡핑: 전사 후, mRNA 전사체에 5’ 캡 구조를 추가하여 호스트 세포 내 안정성과 전이를 향상시킵니다. 캡은 다음 두 가지 방법으로 추가할 수 있습니다:
- 전사 동시 캡핑: IVT 단계에서 수행됩니다. 그러나 효율과 수율이 낮으며, 잘못된 결합이나 역방향 통합으로 인해 캡이 부착되지 않은 불순물이 발생할 수 있습니다.
- 효소적 캡핑(또는 번역 후 캡핑): mRNA 정제 후 수행됩니다. 이 방법은 일반적으로 캡핑 효소를 사용하여 정제된 mRNA에 캡을 부착합니다. 이 방법은 효율이 더 높지만 비용이 더 많이 들고, 정제 후 추가적인 공정 단계가 필요합니다.
mRNA 정제
체외 전사 후, mRNA는 내독소, 면역원성 이중가닥 RNA(dsRNA), 잔류 DNA 템플릿, RNA 중합효소 및 원소 불순물을 포함하여 이전 단계에서 사용된 불순물과 물질로부터 정제됩니다. mRNA 정제 및 잔류 DNA 제거를 위한 여러 가지 방법이 있습니다.
역상 이온 쌍(IPRP), 음이온 교환(AEX) 및 폴리(dT) 포획을 이용한 친화성 크로마토그래피(AC)(그림 3)와 같은 크로마토그래피 분리는 표적 mRNA를 효율적으로 정제하고 DNA 템플릿을 제거하여 DNA 분해 과정을 생략할 수 있게 해줍니다¹⁻³. 또한 효소적 캡핑 후에도 크로마토그래피를 사용하여 원치 않는 mRNA 전사체와 올리고뉴클레오티드 불순물을 제거합니다.
그림 3:mRNA 정제를 위한 역상 이온쌍, 음이온 교환 및 친화성 크로마토그래피의 비교 (DBC: 동적 결합 용량).4,5
- 역상 이온 페어링(IPRP)은 소규모로 적용하여 표적 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 효율적으로 포집하고 불순물로부터 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 용매를 필요로 하기 때문에 GMP 제조에는 적합하지 않으며, 포집보다는 정제 단계에 더 적합합니다.
- 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피는 높은 동적 결합 용량을 가지며, 이중가닥 RNA(dsRNA), 캡이 없는 RNA, RNA-DNA 하이브리드 및 헤어핀 mRNA와 같은 기타 RNA 구조물과 같은 불순물을 효율적으로 제거합니다. AEX는 수용액을 사용하지만, 수지에 결합된 대형 mRNA 분자를 탈착시키기 위해 잠재적으로 독성이 있는 카오트로픽 제제와 최대 85°C의 작동 온도가 필요합니다.
- 친화성 크로마토그래피(AC) 폴리(dT) 포획법은 수지를 사용하여 전체 길이 mRNA 전사물의 폴리(A) 꼬리를 특이적으로 포획합니다. 이 방법은 DNA, 뉴클레오티드, 효소, 완충액 성분 및 폴리(A) 꼬리가 없는 기타 불순물을 효율적으로 제거합니다. 이러한 이유로 AC는 일반적으로 초기 mRNA 포획에 사용되며, 이후 정제를 위해 AEX가 이어집니다.
- 크로마토그래피 단계가 완료된 후에는 최종 농축 및 다이아필트레이션이 수행되어 제품의 순도를 극대화하고, mRNA를 제형화 또는 보관을 위한 적절한 완충액으로 옮깁니다.
확대 생산 시 고려 사항
일회용 기술은 다수의 표적 파이프라인을 보유한 제조업체에 확장성, 적응성 및 품질을 제공하며, 많은 mRNA GMP 제조 공정의 핵심 기반이 됩니다. GMP 제조는 효율적인 대규모 분리를 위해 TFF(유동층 여과) 또는 크로마토그래피 단계의 장점을 활용하여, 소규모 공정 개발에서 흔히 사용되는 대체 정제 방법을 대체합니다. 유의해야 할 사항은 다음과 같습니다:
- TFF 또는 크로마토그래피 단계는 mRNA 공정 개발에서 흔히 사용되는 용매 추출 및 침전 단계를 대체합니다.
- mRNA의 안정성을 높이고 분해 가능성을 최소화하기 위해 가능한 한 고품질 화학물질과 엔도뉴클레아제 무함유 시약을 사용해야 합니다.
최근 몇 년간 대규모 환자 집단에 mRNA 백신을 보급하는 데 있어 큰 성과를 거두었습니다. 여전히 과제가 남아있지만, 고품질 화학물질과 엔도뉴클레아제 무함유 시약을 사용하여 mRNA 안정성을 극대화하고, 분리 효율을 극대화하며 규모 확대를 간소화하기 위해 크로마토그래피 정제 기술을 최적화하고 맞춤화하는 데 주력한 결과, GMP 제조 템플릿 분야에서 큰 진전이 이루어졌습니다.
mRNA 기술이 그 잠재력을 최대한 발휘할 수 있도록 하려면, 생산 규모에 맞춰 견고한 플랫폼을 구축하기 위한 혁신적인 솔루션과 전문 지식, 그리고 창의성이 필요합니다. 머크는 자사의 제품, 서비스 및 기술 전문성을 바탕으로 귀사의 mRNA 제조 공정을 효율화할 수 있는 통합 솔루션을 개발하는 데 전념하고 있습니다.
참고 문헌
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