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Crecimiento y mantenimiento celular

Células en proliferación de ojo de embrión de pollo en estadio E4 utilizando BrdU

El cultivo celular es una técnica fundamental utilizada en investigación en ciencias de la vida para establecer modelos biológicos apropiados o para producir proteínas recombinantes, partículas víricas o tratamientos biológicos. El crecimiento y el mantenimiento de células cultivadas, como bacterias, levaduras y células de mamífero, se realiza en una cabina de bioseguridad (a menudo denominada campana de cultivo celular o tisular) utilizando una técnica estéril apropiada para evitar la contaminación microbiológica y química.   

Tipos de cultivo celular

Dos de los enfoques más destacados para el cultivo de células de mamífero son el cultivo primario y el cultivo continuo. Los cultivos primarios proceden directamente de los tejidos humanos o animales y su esperanza de vida en cultivo está limitada por la senescencia celular. Los cultivos continuos se consideran «inmortales» en cultivo, ya que a menudo derivan de tejidos cancerosos de los pacientes. Las líneas celulares también pueden crearse inmortalizando las células y pueden propagarse en serie opasadas durante numerosos ciclos de división celular o indefinidamente.


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Mantenimiento y proliferación de células en cultivo

Las células pueden cultivarse en suspensión o como una monocapa bidimensional que se une al matraz de cultivo o a la placa multipocillos. El método de cultivo viene determinado por el tejido de procedencia de las células; las células provenientes de la sangre generalmente crecen en suspensión, mientras que las derivadas de los tejidos sólidos suelen crecer en monocapas.

Se considera en general que los modelos de cultivo celular tridimensional (organoides y esferoides) imitan mucho mejor el entorno in vivo de la célula en comparación con las cultivadas en superficies bidimensionales. Los esferoides suelen formarse a partir de líneas celulares cancerosas o de biopsias tumorales (xenoinjertos de pacientes, o PDX) como agregados celulares fluidos en placas de fijación ultrabaja, mientras que los organoides se obtienen normalmente de citoblastos de tejidos incluidos y luego diferenciados en una matriz extracelular de hidrogel.

Fases del crecimiento celular

Garantizar un crecimiento celular adecuado es fundamental para recopilar datos precisos en los estudios de cultivo celular. Los recuentos celulares pueden realizarse utilizando un hemocitómetro o un contador celular automático, que ofrece recuentos celulares más precisos.

El crecimiento celular en el cultivo ocurre en general en cuatro fases:

  1. Fase de latencia: las células se están ajustando a las condiciones del cultivo y no se dividen.
  2. Fase de crecimiento logarítmico (log): las células se dividen activamente, por lo que ésta es la mejor etapa durante la cual evaluar el crecimiento de la población o recopilar datos. La fase logarítmica tardía es el mejor momento para realizar los pases (subcultivos) de las células.
  3. Fase meseta (estacionaria) : el crecimiento se va ralentizando a medida que las células se acercan a la confluencia del 100 %, y las células son más sensibles al estrés o las lesiones conforme se van acumulando los residuos celulares y se agotan los recursos.
  4. Fase de descenso: la población de células vivas disminuye ya que predomina la muerte celular.

Medios, suplementos y reactivos para cultivo celular

Las células cultivadas requieren un suministro de nutrientes para crecer. Los medios para cultivo de células de mamífero deben mantener un pH fisiológico, además de proporcionar concentraciones equilibradas de sales, carbohidratos, aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos y lípidos, proteínas y péptidos, oligoelementos y factores de crecimiento. El suero fetal bovino (FBS) es el suplemento de crecimiento más utilizado para el cultivo de células de mamífero, ya que contiene muchos de estos nutrientes celulares esenciales y se ha demostrado que sustenta el crecimiento de células y tejidos en cultivo. Para aplicaciones que requieren medios definidos o menos componentes animales, las formulaciones de medios sin células xenógenas proporcionan formulaciones sin componentes de origen animal de composición conocida.

Debido a que los medios y los suplementos suelen proporcionar nutrientes ricos para el crecimiento de microorganismos oportunistas, el éxito del cultivo celular requiere una técnica aséptica y una observación regular para garantizar la ausencia de contaminantes que puedan causar la muerte celular o confundir el crecimiento como si fuera in vivo. En el caso de los contaminantes microbianos comunes que no pueden observarse al microscopio, el análisis sistemático con reactivos de detección de micoplasmas protege los cultivos y los entornos de propagación de tejidos.  

Los cultivos de levaduras, como S. cerevisiae y P. pastoris (Pichia), se utilizan comúnmente para investigar la expresión de proteínas recombinantes y en estudios de la función génica. Los nutrientes fundamentales que suelen incluirse en una formulación de medio de cultivo de levaduras son la peptona, el extracto de levadura y la dextrosa o la glucosa.

Consejos y trucos para los pases celulares

Los pases celulares constituyen una etapa fundamental en el cultivo celular general para mantener la salud de las células y un crecimiento celular óptimo. En este tutorial se explica el proceso de pase celular, incluidas la importancia de la confluencias y la densidad celular. El protocolo para los pases celulares implica procesos tales como la supervisión y el recuento de las células, la tripsinización o disociación de células, y la resiembra de las células en un nuevo material de cultivo.

Entornos de cultivo celular y material de cultivo

Las células se cultivan y manipulan utilizando material de plástico estéril de un solo uso, como matraces de cultivo tisular y placas multipocillos, pipetas serológicas, filtros de tapa de botella estériles y filtros de jeringa estériles. Los matraces y las placas de plástico para cultivo de tejidos suelen tratarse para proporcionar una superficie hidrófila que facilita la fijación de las células adherentes. Como alternativa a las superficies en 2D, las placas con membrana microporosa proporcionan un entorno de crecimiento más fisiológico para pruebas celulares complejas, como la migración celular, la comunicación entre células y la polarización celular.

Las células cultivadas deben mantenerse a la temperatura y en el entorno gaseoso que recreen el valor de estos parámetros en el organismo del que proceden. El material de cultivo que contiene las células y los medios se mantiene normalmente en equipos de incubación que proporcionan un control preciso de la temperatura y las mezclas gaseosas. Sin embargo, los sistemas de incubación de sobremesa a pequeña escala que emplean microfluidos y facilitan la obtención de imágenes de las células en un cultivo ininterrumpido pueden proporcionar los entornos más auténticos para modelos predictivos in vitro.




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