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Aplicaciones de la reacción en cadena la polimerasa (PCR)

La PCR con transcriptasa inversa (RT) sigue estos pasos: aislamiento del ARN o el ARNm, hibridación del cebador, síntesis de la primera cadena y amplificación mediante PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una potente y fundamental técnica de biología molecular.Es un método in vitro eficiente y rápido para la amplificación enzimática de secuencias específicas de ADN o ARN procedentes de varias fuentes. Una PCR convencional consta de un ADN específico, un conjunto de cebadores oligonucleótidos sintéticos que flanquean la secuencia de ADN específico, una ADN polimerasa termoestable (normalmente una polimerasa Taq) y nucleótidos. Utilizando cicladores térmicos, existen tres etapas durante cada ciclo de amplificación que son, la desnaturalización de la doble hebra del ADN (dsDNA) en ADN monocatenarios separados, la hibridación de los cebadores con la secuencia específica de ADN y la extensión, en la cual la ADN polimerasa extiende el ADN desde los cebadores creando nuevos ADN bicatenarios que contienen una hebra antigua y una nueva. Las cadenas sintetizadas en un ciclo sirven como molde en el siguiente, lo que produce un aumento de un millón de veces de la cantidad de ADN en tan sólo 20 ciclos.  

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR, retroPCR)

La retroPCR, PCR con transcriptasa inversa o RT-PCR, es una variación de la técnica de PCR convencional que implica la amplificación del ARNm específico obtenido de muestras muy pequeñas. Elimina la necesidad del tedioso proceso de purificación del ARNm requerido en las técnicas de clonado convencionales. En la retroPCR, se utilizan la transcriptasa inversa y una muestra de ARN además de los reactivos de la PCR convencional. La mezcla de reacción se calienta a 37 ˚C, lo que permite la producción de copias de ADNc complementario a partir de la muestra de ARN mediante la transcriptasa inversa. Este ADN complementario se híbrida a continuación con uno de los celadores, lo que lleva a la síntesis de la cadena primaria. A partir de aquí, sigue la PCR convencional, en la cual se genera en última instancia un ADN bicatenario (dsDNA). La RT-PCR se combina a menudo con la PCR en tiempo real (qPCR), que es muy utilizada para la cuantificación de los niveles de transcritos en células y tejidos.

PCR de inicio en caliente

La PCR de inicio en caliente es una tecnología que inhibe la polimerasa Taq de inicio en caliente o la incorporación de dNTP modificados durante la configuración de la reacción hasta que se produce una etapa de activación con calor. Existen varios métodos para detener la actividad de la polimerasa de inicio en caliente, que son métodos de modificación química, mediados por anticuerpos y mediados por aptámeros. 

PCR de punto final para amplificación larga y precisa de la diana

La PCR de punto final suele utilizarse para detectar la presencia de dianas y su abundancia relativa al finalizar la reacción. La longitud limitada de las secuencias producidas durante la PCR convencional, de aproximadamente 5 kb, se supera en parte con la incorporación de factores añadidos que proporcionan actividad de verificación y corrección. La PCR larga y precisa incorpora la utilización de una segunda polimerasa termoestable con actividad exonucleasa 3′→5′ para reparar las incorporaciones erróneas de nucleótidos terminales, lo que produce un aumento significativo de la fidelidad y la capacidad de amplificar dianas de ADN de hasta 40 kb de longitud.


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