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Análisis de la actividad enzimática

Principios de un análisis de la actividad enzimática

Los análisis de la actividad enzimática los realizan predominantemente los investigadores para identificar la presencia o la cantidad de una enzima específica en un organismo, tejido o muestra. Ejemplos de dichas enzimas son la α-amilasa, la catalasa, la laccasa, la peroxidasa, la lisozima y las enzimas reporteras fosfatasa alcalina y luciferasa. Se encuentran ampliamente disponibles diversos reactivos y metodologías que permiten la investigación de interacciones enzima-sustrato específicas. La selección de una secuencia de trabajo apropiada depende de la sensibilidad que requiera el investigador. Las soluciones colorimétricas son útiles para la detección, mientras que los reactivos fluorescentes son más adecuados para la cuantificación de la actividad enzimática.   

Determinación de las condiciones óptimas para la actividad enzimática

Si bien se han descrito numerosos análisis enzimáticos, esos procedimientos deben modificarse en función de los requisitos específicos de la enzima que se esté investigando. La actividad específica de una enzima depende de numerosos factores, como el pH, la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de todos los componentes en el ensayo. Para condiciones como el pH, la actividad enzimática suele recordar a una campana de Gauss. La mayor actividad a un pH específico se indica como la Vmáx, observándose una disminución de la actividad a ambos extremos de la curva. Algunas enzimas pueden precisar consideraciones añadidas para compuestos que no intervienen directamente en la reacción, como los iones metálicos, los detergentes y las moléculas hidrófobas.


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Componentes de los análisis enzimáticos

Para muchas enzimas, el agua es el disolvente estándar ya que corresponde al mismo entorno acuoso encontrado en las células. Sin embargo, en algunos casos, cuando las enzimas o los componentes enzimáticos son insolubles en agua, se utilizan disolventes orgánicos. Además, los sustratos y los cofactores son también componentes fundamentales en los análisis de la actividad enzimática. Los sustratos y los cofactores suelen identificarse por sus funciones en condiciones fisiológicas. Como tales, sustratos y cofactores interaccionan ampliamente y pueden ser requeridos por una diversa variedad de enzimas. Las disoluciones tampón y los iones son otros elementos fundamentales que considerar ya que son esenciales para estabilizar el pH durante todo el análisis e influyen directamente en la actividad de la enzima. Por ejemplo, pueden necesitarse iones metálicos monovalentes o divalentes para la actividad catalítica de los cofactores en la reacción y son esenciales para la actividad enzimática.

Realización de un análisis enzimático

La preparación de los componentes del análisis enzimático es un primer paso práctico. En general, es conveniente preparar una gran mezcla de ensayo descartando un componente activador para evitar errores de pipeteo que son inherentes al pipetear volúmenes pequeños. Una vez preparada la mezcla, los investigadores añadirán el componente activador final a la mezcla para iniciar el análisis de actividad. El pretratamiento de la enzima conservándola a temperaturas frías y a menudo agregando varios aditivos químicos o proteicos, es un factor crucial para asegurar la estabilidad de la enzima y su actividad máxima antes del inicio del ensayo. Una vez combinados los materiales de reacción en un recipiente de observación, los componentes deben mezclarse completa y rápidamente para que la reacción empiece. El registro de los datos debe iniciarse de inmediato después de la mezcla y la señal detectable debe representarse durante todo el tiempo que dure la reacción.



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