Precipitación pull-down de proteínas
El análisis de precipitación pull-down está diseñado para determinar la interacción de dos o más proteínas. Con los análisis de precipitación por afinidad, se etiqueta una proteína «cebo» y se captura en un ligando inmovilizado (microesferas de soporte) mediante unión covalente o a través de una etiqueta de afinidad como en la cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (IMAC). Las etiquetas de fusión de proteínas cebo habituales son la glutatión S-transferasa (GST) y las proteínas etiquetadas con histidina. La proteína cebo forma un complejo que luego se incuba con una fuente de proteínas como un lisado celular o tisular. Las proteínas de interés se eluyen del soporte de microesferas a través de una serie de lavados y se recogen mediante centrifugación. El método de purificación y detección mediante precipitación por afinidad es diferente de los ensayos de inmunoprecipitación (IP) y co-IP en el sentido de que no hay una interacción anticuerpo-antígeno. Con todos los análisis de precipitación pull-down, la muestra purificada suele analizarse mediante SDS-PAGE, análisis espectral de masas y transferencia Western para los análisis posteriores.
Aplicaciones de la precipitación por afinidad con GST
La glutatión S-transferasa (GST) es una proteína de 211 aminoácidos que se encuentra en la mayoría de los organismos. La GST se integra a menudo en vectores de expresión para producir la etiqueta de fusión dentro de los sistemas de expresión de proteínas de E. coli. La etiqueta GST es una etiqueta proteica grande, de aproximadamente 26 kDa, y puede expresarse en bacterias, levaduras, células de mamífero y de insecto. La etiqueta GST es conveniente cuando es necesario proteger la proteína recombinante de la escisión intracelular por proteasas y cuando debe mejorarse la solubilidad de la proteína etiquetada. Además, la proteína GST proporciona una etiqueta de alta afinidad para facilitar la purificación y para experimentos de precipitación utilizando resinas de afinidad económicas que se realizan en condiciones de elución suave.
Co-inmunoprecipitación
El análisis pull-down es ideal para la verificación de los resultados de la coinmunoprecipitación y un excelente método para identificar interacciones interproteicas desconocidas junto con el estado de activación de proteínas específicas. A diferencia de los métodos de precipitación por afinidad, en la IP se utilizan anticuerpos para unirse a, y asilar, los antígenos de muestras biológicas complejas.
Por co-IP se entiende el uso de un anticuerpo para unirse a un antígeno en un complejo multiproteico. A continuación, el complejo es capturado con la adición de un medio de proteína A o proteína G. La elevada afinidad de la proteína A/G con la región Fc de los anticuerpos IgG policlonales y monoclonales los convierte en un componente fundamental en la purificación de la proteína o el complejo proteico de interés. Los métodos de precipitación de proteínas constituyen una herramienta esencial para investigar las redes de interacción proteína-proteína; sin embargo, la elección del método específico vendrá determinada por la aplicación específica que precise el investigador.
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