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Inmunoelectrotransferencia

Laboratorio de inmunoelectrotransferencia. Técnica de transferencia Western para la detección de proteínas

La transferencia Western o inmunoelectrotransferencia es una técnica analítica bien establecida para detectar, analizar y cuantificar proteínas. Este método se utiliza mucho para detectar moléculas proteicas específicas en muestras complejas como homogeneizados de tejidos y lisados celulares. La transferencia Western implica normalmente la separación de proteínas mediante electroforesis en gel seguida de la transferencia a una membrana de nitrocelulosa o de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Una vez transferidas las proteínas, pueden teñirse para su visualización e identificarse directamente mediante secuenciación N-terminal, espectrometría de masas o inmunodetección.

En la inmunodetección de la transferencia Western, las proteínas se identifican mediante su unión a anticuerpos específicos. Normalmente se utiliza un anticuerpo primario en combinación con un anticuerpo secundario conjugado con HRP o AP para la detección quimioluminiscente o colorimétrica utilizando un sustrato adecuado. También puede utilizarse un anticuerpo primario o secundario marcado con fluorescencia para la visualización directa.

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La inmunoelectrotransferencia se utiliza mucho en bioquímica para detectar la presencia de proteínas específicas, determinar el alcance de las modificaciones postraduccionales, verificar la expresión de proteínas en aplicaciones de clonación, analizar los niveles de expresión de proteínas y biomarcadores, en la cartografía de epítopos de anticuerpos y para comprobar la presencia de marcadores de enfermedad en entornos clínicos.

La necesidad de analizar simultáneamente más proteínas en muestras limitadas ha impulsado la investigación para mejorar la sensibilidad y la velocidad de las técnicas de transferencia. La transferencia doble elimina los falsos positivos causados por interacciones inespecíficas. La transferencia far-western permite la detección de interacciones específicas entre proteínas. La transferencia southwestern se utiliza para identificar proteínas que interactúan con secuencias específicas de ADN. La transferencia de tiras múltiples aumenta el rendimiento al tiempo que minimiza la variabilidad entre transferencias. Se están desarrollando nuevas tecnologías para reducir las cantidades de proteína requeridas para producir una señal y mejorar las capacidades cuantitativas de la transferencia Western.

Procedimiento de trabajo

Lisis celular de proteínas para transferencia Western.

Extracción de proteínas

Cuando se trabaja con células o tejidos, deben romperse las muestras para aislar las proteínas antes del análisis. En los tampones de lisis y extracción se utilizan detergentes para descomponer las paredes y las membranas celulares y liberar así las proteínas. El tampón óptimo debe elegirse en función del tipo de muestra y la ubicación subcelular de la proteína específica.

Cámara de electroforesis en gel para desplazamiento de las proteínas en los geles

Se utiliza la electroforesis en gel de proteínas para separar y resolver las proteínas antes de la transferencia. La mezcla de proteínas preparada se ejecuta en un gel de poliacrilamida para clasificar las proteínas por peso molecular y carga.

Transferencia de proteínas a membrana de PVDF para detección utilizando técnicas de inmunoelectrotransferencia.

Las proteínas separadas en el gel por la electroforesis se inmovilizan al transferirlas a una membrana de PVDF o de nitrocelulosa. En la transferencia se utiliza corriente eléctrica para arrastrar proteínas del gel a la membrana (electrotransferencia).

Inmunoelectrotransferencia. Detección de la proteína diana mediante anticuerpos primarios y secundarios conjugados con HRP con sustrato.

La proteína diana se detecta utilizando un anticuerpo primario en combinación con un anticuerpo secundario conjugado con HRP o AP y un sustrato quimioluminiscente o colorimétrico adecuado, o utilizando un anticuerpo primario o secundario marcado con fluorescencia.

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