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Determinación de la oxidación de fosfolípidos mediante espectroscopia UV/VIS - Avanti® Polar Lipids

Definición

El porcentaje de oxidación de un fosfolípido se puede determinar utilizando la Ley de Beer para calcular la concentración de fosfolípido peroxidado a partir de su absorbancia a 234 nm.

Alcance

Aplicable a todos los fosfolípidos insaturados.

Aparato

  • Espectrofotómetro UV/VIS
  • Cubeta para muestra de cuarzo HELLMA UV (QS 1.000)
  • Toallitas húmedas
  • Tubos de vidrio desechables

Reactivos

  • Etanol (graduación 200, deshidratado según USP)
  • Agua desionizada
  • 16:0 PC (DPPC)

Procedimiento

  1. Preparación la muestra de DPPC. Prepare un mínimo de 3 ml de una disolución 1 mg/ml de DPPC disuelta en etanol/agua desionizada (9:1).
  2. Preparación de la muestra. Prepare un mínimo de 3 ml de una disolución 1 mg/ml de la muestra de fosfolípidos disuelta en etanol/agua desionizada (9:1).
  3. Procesado del blanco. El blanco (fondo) es el disolvente utilizado para disolver las muestras de fosfolípidos.
    • Enjuague la cubeta de muestra con el disolvente tres veces para eliminar los restos de contaminantes de la cubeta.
    • Llene 3/4 de la cubeta de muestra con la referencia.
    • Utilice una toallita húmeda para eliminar todas las huellas dactilares y contaminantes del exterior de la cubeta de muestra.
    • Introduzca la cubeta de muestra en el espectrofotómetro y ejecute un espectro en blanco.
  4. Procesado de la muestra de DPPC.
    • Tire el disolvente blanco de la cubeta de muestra.
    • Llene 3/4 de la cubeta de muestra con la disolución de muestra de DPPC.
    • Retire las huellas dactilares del exterior de la cubeta de muestras.
    • Introduzca la cubeta de muestra en el espectrofotómetro y ejecute un espectro del DPPC.
  5. Procesado de la muestra.
    • Tire la muestra de DPPC de la cubeta de muestra.
    • Enjuague la cubeta de muestra con el disolvente tres veces para eliminar los restos de DPPC de la cubeta.
    • Llene 3/4 de la cubeta de muestra con la muestra de fosfolípidos.
    • Retire las huellas dactilares del exterior de la cubeta de muestras. Introduzca la cubeta de muestra en el espectrofotómetro y ejecute un espectro de la muestra.
    • Reste el espectro de DPPC del espectro de la muestra y registre la lectura de absorbancia (OD) de la muestra de fosfolípidos a 234 nm.

Cálculos

Concentración de lípidos peroxidados (D) = A/(B*C)
A = lectura de absorbancia (OD) a 234 nm
B = coeficiente de extinción en (OD*ml)/(mmol*cm) (27 000 para lípidos peroxidados)
C = Longitud de trayectoria en cm Porcentaje de oxidación = D/E * 100
D = concentración de lípidos peroxidados en mg/ml
E = concentración de la muestra lipídica = 1,0 mg/ml

Materiales
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Referencias bibliográficas

1.
Kim R, LaBella F. 1987. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid Res. 28:1110-1117.
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