Elektroforeza żelowa

Istnieje kilka metod elektroforezy żelowej białek, z których każda dostarcza odrębnych informacji na temat białek będących przedmiotem zainteresowania:

SDS-PAGE

Elektroforeza żelowa z dodecylosiarczanem sodu (SDS) i poliakryloamidem (PAGE) umożliwia rozdział białek na podstawie masy cząsteczkowej. W tej metodzie detergent SDS jest włączany do buforu roboczego. SDS nadaje białkom ujemny ładunek netto, maskując ich wewnętrzny ładunek. Gdy białka są rozdzielane w obecności SDS i odczynników denaturujących, stają się mniej kuliste i bardziej liniowe. W rezultacie szybkość, z jaką białka związane z SDS migrują przez żel, zależy przede wszystkim od ich wielkości, umożliwiając oszacowanie masy cząsteczki poprzez porównanie z wzorcami białek.

Native PAGE

.W natywnej elektroforezie w żelu poliakrylamidowym białka są rozdzielane w sposób, który zachowuje ich natywną konformację (strukturę trzeciorzędową), interakcje podjednostkowe (strukturę czwartorzędową i interakcje białko-białko) oraz aktywność biologiczną. W tej metodzie białka są przygotowywane i poddawane działaniu nieredukujących, niedenaturujących warunków. Ruchliwość białek jest określana przez złożoną kombinację czynników, ponieważ każde białko może migrować w kierunku dowolnej elektrody w zależności od jego ładunku oraz z szybkością zależną od jego kształtu i zachowania wiązania. Z tego powodu natywna PAGE nie jest zalecana do określania masy cząsteczkowej. Natywna PAGE jest zwykle używana w zastosowaniach wymagających oczyszczania aktywnego białka lub wykrywania przez przeciwciało, które rozpoznaje tylko natywną formę białka.

Ogniskowanie izoelektryczne (IEF)

Ogniskowanie izoelektryczne wykorzystuje zarówno pole elektryczne, jak i gradient pH do oddzielania białek według ich natywnego punktu izoelektrycznego (pI). Gdy białka poruszają się w gradiencie pH, zmienia się ich ładunek netto. Pod wpływem pola elektrycznego każde białko migruje do pH, w którym jego ładunek netto wynosi zero (określanego jako punkt izoelektryczny białka). Podczas procesu rozdzielania, białka w próbce gromadzą się lub "ogniskują" w określonych i przewidywalnych miejscach w żelu. Ogniskowanie izoelektryczne jest stosowane w identyfikacji białek ze złożonych próbek (np, lizaty komórkowe i tkankowe, osocze), analizie modyfikacji potranslacyjnych i rozdzielaniu próbek do analizy spektrometrii mas.

2D PAGE

Dwuwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym umożliwia rozdzielenie białek zgodnie z ich wewnętrznym punktem izoelektrycznym (pI) i masą. Rozdzielenie według pI następuje poprzez ogniskowanie izoelektryczne (IEF). Rozdzielenie według masy następuje poprzez SDS-PAGE. 2-D PAGE zapewnia największą rozdzielczość analizy białek i jest powszechnie stosowany w badaniach proteomicznych do rozdzielania setek do tysięcy białek na jednym żelu.