Listeria: Bakterie, które przetrwały

Bakteria na fali wznoszącej, czerpiąca zyski z dzisiejszych trendów w typach produktów spożywczych

Listerioza to poważna infekcja wywoływana przez Listeria monocytogenes. W ostatnich latach uznano, że Listeria jest ważnym problemem zdrowia publicznego. Choroba dotyka przede wszystkim osoby w zaawansowanym wieku, kobiety w ciąży, noworodki i dorosłych z osłabionym układem odpornościowym.

Listerioza objawia się objawami grypopodobnymi, gorączką, bólami mięśni, a czasami objawami żołądkowo-jelitowymi, takimi jak nudności lub biegunka. Jeśli infekcja rozprzestrzeni się na układ nerwowy, mogą wystąpić objawy takie jak ból głowy, sztywność karku, dezorientacja, utrata równowagi lub drgawki. Poważny atak choroby może prowadzić do zatrucia krwi, zapalenia mózgu i zapalenia opon mózgowych.

Zakażone kobiety w ciąży mogą doświadczyć jedynie łagodnej, grypopodobnej choroby, ale może to prowadzić do poronienia lub martwego porodu, przedwczesnego porodu lub zakażenia noworodka.

W ostatnich latach przeprowadzono wiele badań dotyczących mechanizmu, który ten patogen wykorzystuje do inwazji gospodarza i stwierdzono, że L. monocytogenes  szybko replikuje się w cytozolu komórek gospodarza, takich jak makrofagi i limfocyty (4).

.

Dlaczego ostatnio wzrosła liczba zakażeń Listerią?

Dzisiaj głównym problemem jest zmiana wzorców konsumpcji żywności i zwiększone zapotrzebowanie na dłuższy okres przydatności do spożycia. Rosnąca różnorodność produktów spożywczych i trend na produkty "gotowe do spożycia" i "gotowe do gotowania" to tylko niektóre z przyczyn takich problemów, podobnie jak dłuższe przechowywanie w niskich temperaturach (4-8 °C). Technologie przygotowywania, takie jak "Cook Chill", "sous-vide" i inne nowe procesy mające na celu wydłużenie okresu przydatności do spożycia doprowadziły do zwiększenia problemów z Listerią.

Rysunek 1. Forma L bakterii Listeria monocytogenes (źródło: M. Loessner i Y. Briers, ETH Zurich)

Natura bakterii Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes jest Gram-dodatnią, nietworzącą zarodników wiciowcem o kształcie pręcika (Rysunek 2). Jest wszechobecnym organizmem, występuje w roślinach, glebie i jelitach ptaków, ryb, skorupiaków i niektórych ssaków, w tym ludzi. Niektóre badania sugerują, że 1-10% ludzi może być nosicielami L. monocytogenes w jelitach. Materiały szczególnego ryzyka to surowe lub przetworzone mięso, surowe produkty mleczne, surowe lub wędzone ryby, gotowe sałatki i długo przechowywana żywność pakowana próżniowo.

Rysunek 2. Mikrografia elektronowa bakterii Listeria monocytogenes w tkance.

Listeria monocytogenes jest czynnikiem zakaźnym odpowiedzialnym za chorobę przenoszoną przez żywność - listeriozę. Szacuje się, że każdego roku w Stanach Zjednoczonych około 2500 osób poważnie choruje na listeriozę. Spośród nich 500 umiera. (źródło: Dr Balasubr Swaminathan; Peggy Hayes; CDC - Division of Bacterial and Mycotic Diseases: Listeriosis, 2002)

Listeria gatunki są zabijane przez etapy ogrzewania, ale bakteria jest stosunkowo niewrażliwa na wysokie stężenie soli i kwasów. Jest również zdolna do namnażania się w temperaturach lodówki i wewnątrz opakowań próżniowych.

Testy biochemiczne i metody hodowli

Profil biochemiczny Listeria obejmuje: katalazę dodatnią, oksydazę ujemną, fermentację węglowodanów do kwasu, ale nie do gazu, hydrolizę eskuliny i hippuranu sodu, czerwień metylową dodatnią, produkcję amoniaku z argininy, ujemną reakcję produkcji siarkowodoru, indol ujemny, reduktazę azotanową ujemną, brak upłynniania żelatyny, brak hydrolizy skrobi i brak hydrolizy mocznika.

Dalsze różnicowanie Listeria ssp, szczególnie L. monocytogenes, przy użyciu właściwości fenotypowych jest możliwe dzięki dodatkowym testom biochemicznym. Wszystkie one rozpoczynają się od testu ß-hemolizy (L. monocytogenes jest pozytywny), po którym następuje wykrycie zdolności fermentacji węglowodanów. Jedną z możliwości jest pozytywny wynik testu na fermentację ramnozy i α-D-mannopiranozydu metylu oraz pozytywny wynik testu CAMP. W teście CAMP niektóre gatunki Listeria wykazują zdolność do zwiększania hemolizy Staphylococcus aureus. Więcej szczegółów na temat tej pierwszej metody można znaleźć w Internecie na stronie Rhamnose Broth data sheet. Inną możliwością identyfikacji fenotypu jest testowanie zdolności fermentacji ramnozy, ksylozy i mannitolu (patrz schemat identyfikacji Rysunek 7).

Interesującym tematem i inteligentnym rozwiązaniem do potwierdzenia obecności L. monocytogenes są pożywki chromogenne. Istnieją różne pożywki chromogenne dostępne w handlu, najważniejszym agarem jest agar Listeria według Ottavani i Agosti, który został opisany w ISO 11290 części 1 (wykrywanie Listeria monocytogenes i Listeria spp.) i część 2 (liczenie Listeria monocytogenes i Listeria spp.), w FDA-BAM i w kilku innych przepisach krajowych. Agar ten wykorzystuje następujące systemy do różnicowania:

1. Wykrywanie aktywności ß-glukozydazy poprzez włączenie X-glu = 5-bromo-4-chloro-3-indolilo ß-D-glukopiranozydu jako substratu chromogennego). Enzym ten jest powszechny we wszystkich gatunkach Listeria i pojawiają się one jako niebiesko-zielone kolonie na tym agarze.
2. Wykrywanie patogennych Listeria poprzez włączenie lecytyny, która jest fosfolipazą C specyficzną dla fosfatydyloinozytolu na podłożu selektywnym.Listeria monocytogenes  hydrolizuje specyficznie oczyszczony substrat dodany do podłoża agarowego, tworząc nieprzezroczystą aureolę wokół niebiesko-zielonych kolonii. Większość bakterii Listeria ivanovii również wytwarza nieprzezroczystą otoczkę wokół kolonii po 48 godzinach. Niepatogenne gatunki Listeria, takie jak Listeria innocua wykazują tylko niebiesko-zielone kolonie.

Więcej informacji na temat systemów wykrywania chromogennych i innych nośników potwierdzających znajduje się w tabeli 2c. Aby zapewnić selektywność pożywki, dodaje się do niej fenyloetanol oraz wysokie stężenie chlorku litu i chlorku sodu. Jak również antybiotyki, takie jak moksolaktam, kwas nalidyksowy, siarczan polimyksyny B, ceftazydym, amfoterycyna B, akryflawina, cykloheksymid, siarczan kolistyny, cefotetan i fosfomycyna są stosowane w celu zahamowania wzrostu grzybów, bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich.

Rysunek 3. Protokół ISO (ISO 11290-1:2017 i ISO 11290-2:2017) do wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i Listeria spp.

Szybkie metody

Oprócz klasycznych metod, możemy również zaoferować szereg szybkich metod, które również spełniają różne wymogi regulacyjne. Obejmują one metody immunologiczne, takie jak Assurance^® EIA i TRANSIA^® PLATE screen, lub metody molekularne, takie jak Assurance GDS^® system.

Podłoża i testy

Dzięki innowacjom naszych chemików opracowaliśmy i skomercjalizowaliśmy niezawodne podłoża i testy biochemiczne dla wielu patogenów, w tym Listeria zgodnie z metodologią EN/ISO. Pożywki zawierają elementy niezbędne do selektywnego wzrostu i identyfikacji Listeria w substancjach spożywczych zgodnie z zalecanymi i ustalonymi metodami. Testy biochemiczne zostały zaprojektowane w celu uzyskania łatwych, szybkich i wiarygodnych wyników.

Wspólne pożywki, testy i powiązane produkty są bardziej szczegółowe i posortowane w tabelach 2a-c i 3.

Zgodność ze znowelizowaną normą ISO 11290:2017

Wdrożyliśmy wszystkie wymagania opisane zarówno w części 1, jak i części 2 znowelizowanej normy
EN ISO 11290:2017. Nasze granulowane pożywki GranuCult^® , wstępnie ważone granulowane pożywki Readybag® w gotowych do użycia workach, ReadyPlate™ i ReadyTube^® gotowe do użycia pożywki są zgodne z normą EN ISO 11133:2014. Wszystkie informacje dotyczące zgodności z dodatkowymi normami referencyjnymi znajdują się na etykiecie produktu oraz w informacjach technicznych dostępnych na naszej stronie internetowej.

Dostępne są następujące podłoża hodowlane i akcesoria opisane w zmienionej normie EN ISO 11290:2017:

Podłoża do wstępnego i selektywnego wzbogacania

Popularne nośniki, testy i powiązane produkty: Tabela 2a

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Response not successful: Received status code 500

Rysunek 4. Fraser broth (69198)

Plating out Identification Media: Tabela 2b

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Response not successful: Received status code 500

Podłoże potwierdzające (do różnicowania): Tabela 2c

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Response not successful: Received status code 500

Testy biochemiczne: Tabela 3

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Response not successful: Received status code 500

Rysunek 6. Listeria mono Differential Agar (Agar Listeria Ottaviani & Agosti, 77408)

Rysunek 7. Schemat identyfikacji biochemicznej Listeria spp. na podstawie testów fermentacji węglowodanów i hemolizy (Źródło: Handbook of Listeria monocytogenes, 2008)

Certyfikowany materiał referencyjny

Do testowania wydajności pożywek i testów, stosowanie krążków Vitroids™ i LENTICULE® oszczędza czas, ponieważ eliminuje potrzebę przygotowywania kultur podstawowych. Organizmy nie wymagają czasu regeneracji ani etapu wstępnego wzbogacania. Ponadto stężenia produktu są zaprojektowane w zakresie, w którym nie są potrzebne żadne lub tylko minimalne rozcieńczenia. Krążki łatwo rozpuszczają się w płynnych pożywkach i automatycznie na płytkach agarowych, co zapewnia łatwą obsługę i bardzo ekonomiczne rozwiązanie. Wykorzystanie nowych technologii pozwoliło nam wprowadzić znaczące ulepszenia w dziedzinie mikrobiologicznych materiałów referencyjnych. Główne obszary rozwoju to stabilność, odporność na temperaturę, dostosowanie wąskiego zdefiniowanego zakresu CFU, czas rehydracji i lepsza powtarzalność w obrębie partii. Ponadto każdy krążek jest produkowany zgodnie z normą ISO 17034 (produkcja materiałów referencyjnych) i certyfikowany zgodnie z normą ISO/IEC 17025.

Rysunek 8. Vitroids™ i dyski LENTICULE®

Produkt dodatkowy

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Response not successful: Received status code 500

Referencje

1. 2003. Food-Borne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook: The “Bad Bug Book” U.S. FDA/CFSAN. Center for Food Safety and Applied Nutrition, Food and Drug Administration. [Internet]. College park:

2. Cossart P, Bierne H. 2001. The use of host cell machinery in the pathogenesis of Listeria monocytogenes. Current Opinion in Immunology. 13(1):96-103. https://doi.org/10.1016/s0952-7915(00)00188-6

3. 2008. Consumer Tips: Protect Against Food Infection With Listeria. [Internet]. Available from: https://www.bfr.bund.de/cm/350/verbrauchertipps-schutz-vor-lebensmittelinfektionen-mit-listerien.pdf

4. Birmingham CL, Canadien V, Kaniuk NA, Steinberg BE, Higgins DE, Brumell JH. 2008. Listeriolysin O allows Listeria monocytogenes replication in macrophage vacuoles. Nature. 451(7176):350-354. https://doi.org/10.1038/nature06479

5. Liu D. 2008. Epidemiology.27-59. https://doi.org/10.1201/9781420051414.ch2