Wektory pGEX

Białka znakowane GST są konstruowane poprzez wstawienie genu lub fragmentu genu do MCS jednego z 13 wektorów pGEX. Ekspresja odbywa się pod kontrolą promotora tac, który jest indukowany przez analog laktozy - izopropyl β-D-tiogalaktozyd (IPTG). Wszystkie wektory pGEX są również wyposażone w wewnętrzny gen lacIq. Produkt genu lacIq jest białkiem represorowym, które wiąże się z regionem operatorowym promotora tac, zapobiegając ekspresji do czasu indukcji przez IPTG, utrzymując w ten sposób ścisłą kontrolę nad ekspresją wstawki.

Dziewięć wektorów ma rozszerzony MCS, który zawiera sześć miejsc restrykcyjnych. Rozszerzony MCS ułatwia jednokierunkowe klonowanie wstawek cDNA uzyskanych z bibliotek skonstruowanych przy użyciu wielu dostępnych wektorów lambda. pGEX-6P-1, pGEX-6P-2 i pGEX-6P-3 kodują sekwencję rozpoznawania dla specyficznego dla miejsca rozszczepienia przez PreScission Protease między domeną GST a MCS. pGEX-4T-1, pGEX-4T-2 i pGEX-4T-3 pochodzą od pGEX-2T i zawierają miejsce rozpoznawania trombiny. pGEX-5X-1, pGEX-5X-2 i pGEX-5X-3 są pochodnymi pGEX-3X i posiadają miejsce rozpoznawania czynnika Xa (Tabela 1.1).

Tabela 1.1. Miejsca rozszczepienia proteaz wektorów pGEX

Vector	Cleaved by
pGEX-6P-1, pGEX-6P-2, pGEX-6P-3	PreScission Protease
pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-1λT, pGEX-2T	Thrombin
pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pGEX-3X	Faktor Xa
pGEX-2TK	trombina
Umożliwia wykrywanie wyrażonych białek poprzez bezpośrednie znakowanie in vitro

pGEX-2TK ma inny MCS niż pozostałe wektory. pGEX-2TK został zaprojektowany w celu umożliwienia wykrywania ekspresjonowanych białek poprzez bezpośrednie znakowanie znakowanych produktów in vitro. Wektor ten zawiera sekwencję rozpoznającą podjednostkę katalityczną kinazy białkowej zależnej od cAMP uzyskanej z mięśnia sercowego. Miejsce kinazy białkowej znajduje się pomiędzy miejscem rozpoznawania trombiny a MCS. Eksprymowane białka mogą być bezpośrednio znakowane przy użyciu kinazy białkowej i [γ-32P]ATP i łatwo wykrywane przy użyciu standardowych technik radiometrycznych lub autoradiograficznych. pGEX-2TK jest pochodną pGEX-2T, a jego znakowane białko może być rozszczepiane trombiną.

Łącznie wektory pGEX zapewniają wszystkie trzy ramki odczytu translacji zaczynające się od miejsca restrykcyjnego EcoRI (Rysunek 1.1). Wektory pGEX-1λT, pGEX-6P-1, pGEX-4T-1 i pGEX-5X-1 mogą bezpośrednio akceptować i wyrażać inserty cDNA wyizolowane z bibliotek λgt11.

Refer to Appendix 2 (Regiony kontrolne wektorów pGEX) w celu uzyskania listy regionów kontrolnych wektorów pGEX. Pełne sekwencje DNA i dane miejsc restrykcji są dostępne w GenBank™. Numery akcesyjne GenBank są wymienione w Załączniku 2 (Regiony kontrolne wektorów pGEX).

Rysunek 1.1. Mapa wektorów GST pokazująca ramki odczytu i główne cechy. Wszystkie 13 wektorów ma kodony stop we wszystkich trzech ramkach odczytu poniżej MCS (nie przedstawione na tej mapie). Patrz Załącznik 2 (Regiony kontrolne dla wektorów pGEX) dla regionów kontrolnych 13 wektorów.

Wybierz odpowiedni wektor, aby dopasować ramkę odczytu sklonowanej wstawki.

Zastanów się, która proteaza i warunki rozszczepiania są najbardziej odpowiednie dla docelowego preparatu białka.

wektory PreScission Protease pGEX-6P oferują najbardziej wydajną metodę rozszczepiania i oczyszczania białek znakowanych GST. Rozszczepienie specyficzne dla miejsca jest wykonywane z jednoczesnym unieruchomieniem proteazy na kolumnie. Proteaza ma wysoką aktywność w niskiej temperaturze, dzięki czemu wszystkie etapy mogą być wykonywane w chłodni w celu ochrony integralności białka docelowego. Enzym rozszczepiający i znacznik GST są usuwane w jednym kroku.

Materiały

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Response not successful: Received status code 500