[Przejdź do zawartości](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl) Produkty Koszyk0 PLPL Produkty ProduktyZastosowaniaUsługiZasobyWsparcie [Zaloguj się / Zarejestruj się](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Wyszukiwanie zamówienia](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/order-lookup) [Szybkie zamówienie](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/quick-order) Koszyk0 [Strona główna](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl)[Zastosowania reakcji łańcuchowej polimerazy](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/applications/genomics/pcr)Standardowy protokół PCR # Standardowy protokół PCR ## Jak przeprowadzić reakcję PCR Standardowa procedura reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) składa się z czterech etapów: 1. Wlać wymagane odczynniki lub mieszankę startową oraz matrycę do probówek PCR. 2. Wymieszać i odwirować. \*Dodać olej mineralny, aby zapobiec parowaniu w termocyklerze bez podgrzewanej pokrywy. 3. Przeprowadzić amplifikację zgodnie z parametrami termocyklera i starterów. 4. Ocenić amplifikowane DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie barwiąc bromkiem etydyny.  Poniżej przedstawiono te etapy w sposób bardziej szczegółowy wraz z wskazówkami dotyczącymi doboru materiałów i odczynników. Jest to podstawowy protokół PCR z wykorzystaniem polimerazy DNA Taq. ## Etapy reakcji PCR i niezbędne składniki do przeprowadzenia PCR Rozwiązywanie problemów związanych z reakcją PCR wiąże się z wieloma czynnikami. Obejrzyj tę animację, aby dowiedzieć się, w jaki sposób dobór odpowiednich składników i warunków cyklu dostosowanych do Twoich potrzeb może pomóc w osiągnięciu optymalnych wyników. * * * Dodatkowe protokoły dotyczące innych polimeraz lub zaawansowanych technik PCR znajdziesz w sekcji [„Protokoły”](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-technologies-protocols-introduction) naszego Przewodnika po technologiach PCR. Dowiedz się więcej o standardowej metodzie PCR, w tym o tym, czym ona jest, na naszej [stronie „Podstawy PCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/routine-amplification)”. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Odczynniki: co jest potrzebne do przeprowadzenia PCR? Odczynnik stosowany w PCRZalecany produkt   Polimeraza DNA *Taq*Wybierz polimerazę DNA *Taq* zgodnie z własnymi preferencjami. (Zobacz osobną [tabelę polimeraz *Taq*](https://www.sigmaaldrich.com#taqdnapolymerase) poniżej.) Woda klasy PCRWoda do odczynników PCR Primery rozcieńczone do stężenia roboczego Do większości testów wystarczają roztwory robocze o stężeniu 10 µM. Oligonukleotydy[Oligonukleotydy na zamówienie](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/products/molecular-biology-and-functional-genomics/oligos-and-qpcr-probes/custom-predesigned-dna-oligos-and-qpcr-probes) DNA przeznaczone do amplifikacjiDostarczone przez badacza Specjalne pipety  TermocyklerZ blokami dołków o różnych rozmiarach lub w wersji wieloformatowej Sterylne końcówki do pipet z filtrem  Sterylne probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml z zakrętkąProbówki mikrowirówkowe Corning® z zakrętką Probówki lub płytki do PCRDo wyboru w zależności od typu cyklera:      Pojedyncze cienkościenne probówki do PCR o pojemności 200 µl     Probówki w paskach o pojemności 200 µl     Płytki wielokomorowe i uszczelki do płytek Mieszanka dNTPMieszanka dezoksynukleotydów zawierająca po 10 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP \*gotowe mieszanki zawierają już dNTP ## Czym jest polimeraza *Taq*? Polimeraza DNA *Taq* to termostabilny enzym pochodzący z bakterii termofilnej *Thermus aquaticus.* Jest powszechnie stosowana do amplifikacji fragmentów DNA w reakcji PCR. Enzym występuje w postaci rekombinowanej, wyrażanej w *E. coli*. Jest w stanie wytrzymać wielokrotne podgrzewanie do temperatury 95 °C (jak wymaga tego technika PCR) bez znaczącej utraty aktywności. Masa cząsteczkowa enzymu wynosi około 94 kDa (określona metodą SDS-PAGE), przy czym nie wykryto u niego aktywności endonukleazy ani egzonukleazy. Wykazuje on aktywność polimerazy DNA w kierunku 5'→3' oraz aktywność egzonukleazy w kierunku 5'→3'. Każda partia polimerazy DNA *Taq* jest testowana pod kątem amplifikacji PCR oraz sekwencjonowania dwuniciowego. Enzym jest dostarczany w stężeniu 5 jednostek/µl wraz ze zoptymalizowanym 10-krotnym buforem reakcyjnym. [](https://www.sigmaaldrich.com) ### Standardowa polimeraza DNA *Taq* Skorzystaj z poniższej tabeli, aby wybrać odpowiednią mieszankę polimerazy DNA *Taq* dostosowaną do warunków Twojej reakcji. Wybierz spośród preparatów bezbarwnych lub zabarwionych na czerwono, z chlorkiem magnezu (MgCl₂) lub bez niego, albo gotowych mieszanek typu „readymix” lub „master mix” zawierających bufor i dNTP. Zawiera MgCl₂             Oddziel MgCl₂Gotowa mieszanka                                        Przezroczysta formuła bez barwnikaZ czerwonym barwnikiem do bezpośredniego nakładania na żelePrzezroczysty preparat bez barwnikaZ czerwonym barwnikiem do bezpośredniego nakładania na żelePrzezroczysty preparat bez barwnika Polimeraza DNA *Taq* z *Thermus aquaticus* (D1806)Polimeraza DNA *REDTaq®* (D4309)Polimeraza DNA Taq z *Thermus aquaticus*, bez MgCl₂ (D4545)Mieszanka reakcyjna *REDTaq®* ReadyMix™ do PCR (R2523)Mieszanka reakcyjna ReadyMix™ do PCR *z polimerazą Taq* (P4600) __Definicja jednostki:__ Jedna jednostka odpowiada wbudowaniu 10 nmol całkowitej ilości trifosforanów dezoksyribonukleozydów w DNA wytrącalne kwasem w ciągu 30 minut w temperaturze 74 °C. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Procedura: Etapy reakcji PCR Optymalne warunki dotyczące stężenia polimerazy DNA *Taq*, matrycy DNA, starterów i MgCl₂ zależą od stosowanego systemu. Konieczne może być określenie optymalnych warunków dla każdego składnika z osobna. Dotyczy to w szczególności polimerazy DNA *Taq*, parametrów cyklu oraz stężenia MgCl₂. Zaleca się miareczkowanie enzymu i MgCl₂ w celu ustalenia optymalnej wydajności. 1. __Odczynniki należy dodać do probówki o odpowiedniej pojemności__ w kolejności podanej w tabeli. (Należy wybrać odpowiednią tabelę dla danego zestawu reakcyjnego: standardowego lub gotowego zestawu odczynników.) W przypadku dużej liczby reakcji należy przygotować mieszaninę startową bez matrycy i podzielić ją na porcje w probówkach reakcyjnych. Na koniec do odpowiednich probówek należy dodać matrycę. ### Standardowa reakcja PCR KwotaSkładnikStężenie końcowe w µlWoda  5 µl10x bufor PCR ([P2192](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/P2192) lub [P2317](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/P2317))\*1x 1 µlMieszanka deoksynukleotydów200 µM w µLPrimery forward (zazwyczaj o długości 15–30 zasad)0,1–0,5 µM x µL Primery odwrotne (zazwyczaj o długości 15–30 zasad) 0,1–0,5 µM 0,5 µl Polimeraza DNA *Taq\** 0,05 jednostki/µL y µl DNA matrycowe (zazwyczaj 10 ng) 200 pg/µl z µL 25 mM MgCl₂ (stosować wyłącznie z buforem [P2317](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/P2317)) 0,1–0,5 mM __50 µL__ __Całkowita objętość__ __reakcji__ \*Kup bufor i polimerazę *Taq* w zestawie: D1806, D4309 lub D4545 ### Gotowa mieszanka do reakcji PCR KwotaSkładnikStężenie końcowe 25 µl Gotowa mieszanka ([R2523](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/R2523) lub [P4600](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/P4600))   w µL Primery forward (zazwyczaj o długości 15–30 zasad) 0,1–0,5 µM x µL Primer odwrotny (zazwyczaj o długości 15–30 zasad) 0,1–0,5 µM y µl DNA matrycowe (zazwyczaj 10 ng) 200 pg/µL z µl Woda   __50 µL__ __Całkowita objętość reakcji__ 2\. __Delikatnie wymieszać za pomocą wirówki i krótko odwirować,__ aby wszystkie składniki osadziły się na dnie probówki. Uwaga: Jeśli używasz termocyklera bez podgrzewanej pokrywy, dodaj 50 µl oleju mineralnego na wierzch każdej probówki, aby zapobiec parowaniu. 3\. __Przeprowadzić amplifikację.__ Parametry amplifikacji będą się różnić w zależności od zastosowanych starterów i termocyklera. Konieczne może być zoptymalizowanie systemu pod kątem poszczególnych starterów, matrycy i termocyklera. ### Typowe parametry cyklu Zaleca się przeprowadzenie 25–30 cykli amplifikacji. Etap PCRTemperatura °CCzas trwania Denaturacja matrycy 94 °C 1 min Hybrydyzacja starterów 55 °C 2 min Wydłużanie łańcucha 72 °C 3 min 4\. __Wzmocnione DNA można zbadać za pomocą [elektroforezy w żelu agarozowym](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/nucleic-acid-gel-electrophoresis/nucleic-acid-electrophoresis), a następnie barwiąc je bromkiem etydyny.__       Uwaga: Warstwę oleju mineralnego można usunąć poprzez jednokrotną ekstrakcję chloroformem (w stosunku 1:1), odzyskując fazę wodną. ### [](https://www.sigmaaldrich.com)Odczynniki do elektroforezy kwasów nukleinowych - Agarozę (gotowe żele, proszek itp.) - Bufor, taki jak MOPS-EDTA-octan sodu, tris-octan-EDTA (TAE) lub tris-boran-EDTA (TBE) - Roztwór do nakładania na żel i bufor do nakładania próbek RNA - Barwnik do elektroforezy, np. bromek etydyny 1\. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. [https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695](https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695) 2\. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. [https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371](https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371) 3\. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press. 4\. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press. 5\. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. [https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436](https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436) 6\. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell. 7\. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. [https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989](https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989) 8\. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. [https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775](https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775) 9\. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press. 10\. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 11\. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. [https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465](https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465) 12\. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. [https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266](https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266) ## Oświadczenie dotyczące licencji na etykietę ### UWAGA DLA NABYWCY: WYŁĄCZENIE ODPOWIEDZIALNOŚCI Z TYTUŁU LICENCJI Zakup niniejszego produktu nie wiąże się z przyznaniem jakiejkolwiek licencji w ramach żadnego z patentów amerykańskich nr 5,804,375, 5,994,056, 6,171,785, 6,214,979, 5,538,848, 5 723 591, 5 876 930, 6 030 787 oraz 6 258 569, a także na odpowiadające im patenty poza terytorium Stanów Zjednoczonych, ani na żadne inne patenty lub zgłoszenia patentowe dotyczące procesów związanych z nukleazą 5’ oraz barwnikiem wiążącym dwuniciowe DNA. W celu uzyskania dalszych informacji prosimy o kontakt z dyrektorem ds. licencji w firmie Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, Kalifornia 94404, USA ## Materiały Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd Response not successful: Received status code 500 __Powiązane artykuły__ - [Instalacja i użytkowanie systemów oczyszczania wody Milli-Q® SQ *2Series*](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/wet-chemical-analysis/installation-use-of-milli-q-2series-water-purification-system) - [Zoptymalizowane wykrywanie Mycoplasma metodą PCR](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-counting-and-health-analysis/optimized-pcr-based-mycoplasma-detection) - [Ekstrakcja DNA i amplifikacja WGA z próbek gleby](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/dna-and-rna-purification/extraction-of-dna-from-soil) - [Protokół ekstrakcji policzkowego DNA i amplifikacji WGA](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/dna-and-rna-purification/extraction-protocol-buccal-swab) - [Protokół ekstrakcji roślinnego DNA i amplifikacji WGA](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/dna-and-rna-purification/extraction-protocol-plant-tissues) - [Tkanka FFPE](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/dna-and-rna-purification/wga1-ffpe) - [Protokół zestawu do amplifikacji DNA SeqPlex](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/next-gen-sequencing/seqxe-protocol) - [Długi i dokładny PCR z RedAccuTaq®](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/pcr/amplification-of-dna-with-red-dye) - [Zobacz więcej](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Powiązane kategorie produktów__ - [Folie i taśmy uszczelniające](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [Standard FAME dla optymalizacji wydajności systemu GC](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/calibration-qualification-and-validation/fame-standard-for) - [Indeks oleju węglowodorowego w próbkach](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/calibration-qualification-and-validation/hydrocarbon-oil-index) - [Analiza GC 37-składnikowej mieszaniny FAME na SP™-2560](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/gas-chromatography/c-analysis-of-a-37-component-fame-mix) - [Oznaczanie triglicerydów i wosków w produktach spożywczych przy użyciu chłodnego wtrysku na kolumnie i kolumny kapilarnej MET-Biodiesel](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/gas-chromatography/determination-of-triglycerides) - [Analizy GC FAME przez elucję w temperaturze wrzenia](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/gas-chromatography/gc-analyses-of-fames) - [Analizy GC wolnych kwasów tłuszczowych](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/gas-chromatography/gc-analyses-of-free) - [Analiza GC glicerydów w oleju kokosowym (organicznym, z pierwszego tłoczenia) na SLB-35ms](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/gas-chromatography/gc-analysis-of-glycerides-in-coconut-oil-organic-extra-virgin) - [Zobacz więcej](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) Góra __Zaloguj się, aby kontynuować__ Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować. Zaloguj się__Nie masz konta użytkownika?__Zarejestruj Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim. An unknown error has occured.