Strategie produkcji szczepionek i leków opartych na mRNA

Dzięki skróconym terminom od etapu badań i rozwoju do badań klinicznych technologia mRNA stanowi obiecujące rozwiązanie nie tylko jako szybki i skuteczny środek reagowania na ogniska chorób zakaźnych, ale także w zakresie opracowywania nowych terapii przeznaczonych do leczenia schorzeń, w przypadku których istnieją niezaspokojone potrzeby terapeutyczne. Technologie mRNA oferują wiele korzyści: doskonały profil bezpieczeństwa, wysoki stopień wszechstronności oraz proces produkcji oparty na matrycach.

W związku z wczesnym sukcesem szczepionek mRNA, dzisiejsi producenci mRNA dążą do poprawy wydajności i produktywności swoich procesów produkcyjnych poprzez zwiększenie stabilności mRNA oraz wdrażanie strategii usprawniających oczyszczanie pDNA i mRNA, a także skalowanie produkcji do standardów GMP.

Zobacz wszystkie nasze produkty i usługi związane z opracowywaniem i produkcją mRNA.

Przegląd sekcji

• Czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy produkcji mRNA
• Wytwarzanie mRNA
• Oczyszczanie mRNA
• Kwestie związane ze skalowaniem

Kwestie związane z produkcją mRNA

Produkcja szczepionek i leków opartych na mRNA przebiega zazwyczaj zgodnie z ustalonym schematem (rysunek 1). Ten uproszczony schemat produkcji wykorzystuje te same materiały reakcyjne dla dowolnego celu i umożliwia producentom mRNA wytwarzanie nowych cząsteczek docelowych przy minimalnych dostosowaniach procesu.

Rysunek 1. Ogólny przegląd procesu produkcji mRNA.

Kilka kluczowych decyzji ma ogromny wpływ na przebieg procesu, wydajność i jakość końcowego produktu mRNA, a jedną z nich jest jakość stosowanych w procesie chemikaliów i surowców. Szczególnie podczas transkrypcji in vitro i dalszego oczyszczania mRNA pozostaje bez ochrony i jest narażone na wysokie ryzyko degradacji enzymatycznej. Stosowanie wysokiej jakości chemikaliów, które zostały przetestowane pod kątem braku aktywności endonukleazy, minimalizuje ryzyko degradacji wywołanej przez RNazę i poprawia stabilność mRNA podczas całego procesu oczyszczania oraz przygotowywania preparatu leczniczego na bazie mRNA.

Ta strona internetowa pomoże Państwu sprostać tym i innym wyzwaniom, dostarczając informacji na temat naszych kompleksowych, zintegrowanych rozwiązań zaprojektowanych w celu usprawnienia produkcji mRNA. Nasza broszura „Substancje chemiczne do produkcji leków na bazie mRNA” zawiera szczegółowe informacje potrzebne do podjęcia świadomych decyzji.

mRNA: Elementy strukturalne i ich funkcje

Konstrukt mRNA został zaprojektowany w celu zapewnienia wydajnej ekspresji interesującego genu. Stabilność, ekspresja genu i wydajna translacja białka zależą od kilku elementów strukturalnych (ryc. 2):

Rysunek 2. Struktura mRNA.

• Region czapeczkowy na końcu 5’ sekwencji: Niezbędny do dojrzewania mRNA, rozpoznawania przez rybosom w celu sprawnego tłumaczenia białka oraz ochrony przed trawieniem przez nukleazy, co zapewnia większą stabilność.
• Regiony niekodujące (UTR) w domenach upstream i downstream regionu kodującego mRNA: Regulują translację, lokalizację i stabilność mRNA; mogą być wykorzystywane do poprawy wydajności ekspresji białka.
• Otwarta ramka odczytu lub region sekwencji kodującej: zawiera gen będący przedmiotem zainteresowania (GOI).
• Ogon poli(A): Kluczowy dla translacji białka i stabilności mRNA poprzez zapobieganie trawieniu przez egzonukleazę 3'.

Wytwarzanie mRNA

Produkcja leków i szczepionek opartych na mRNA rozpoczyna się od matrycy w postaci plazmidowego DNA (pDNA), które następnie ulega linearyzacji i transkrypcji do mRNA.

• Produkcja pDNA: Matryca pDNA zawiera promotor polimerazy RNA zależnej od DNA oraz sekwencję konstruktu mRNA. pDNA jest amplifikowane w komórkach bakteryjnych, które są następnie zbierane i lizowane w celu uwolnienia kolistych cząsteczek pDNA. Lizat ten jest niezwykle lepki, ponieważ zawiera pDNA oraz inne duże, ujemnie naładowane zanieczyszczenia, takie jak RNA, genomowe DNA i endotoksyny pochodzące z komórek bakteryjnych, co utrudnia proces oczyszczania.
• Oczyszczanie pDNA: Oczyszczanie matrycy pDNA z zanieczyszczeń powinno maksymalizować separację, jednocześnie minimalizując ryzyko mechanicznego uszkodzenia matrycy plazmidowej. Oczyszczony, kolistowy pDNA jest następnie linearyzowany, aby uniknąć zjawisk transkrypcyjnego readthrough, które mogą generować niepożądane warianty sekwencji mRNA, które należałoby usunąć.¹ Ten linearyzowany matryca pDNA jest dalej oczyszczana w celu usunięcia zanieczyszczeń, takich jak enzym restrykcyjny użyty do linearyzacji, albumina surowicy bydlęcej (BSA), fragmenty DNA i endotoksyny. Ponieważ matryca pDNA jest zazwyczaj wytwarzana w komórkach bakteryjnych, zanieczyszczenia endotoksynami są krytycznym czynnikiem wpływającym na kolejne etapy oczyszczania. Do skutecznego usuwania endotoksyn można stosować detergenty, takie jak Deviron^® C16, które stanowią zrównoważoną, biodegradowalną i zgodną z REACH alternatywę dla tradycyjnych detergentów.²

Istnieją znaczne różnice w podejściu do oczyszczania pDNA w skali laboratoryjnej i w skali produkcji zgodnej z GMP. W procesach laboratoryjnych często stosuje się techniki ekstrakcji rozpuszczalnikowej w celu oddzielenia pDNA od innych składników, ale obchodzenie się z tymi substancjami chemicznymi i ich utylizacja na dużą skalę może stanowić wyzwanie. Natomiast w środowiskach produkcyjnych zgodnych z GMP zazwyczaj stosuje się filtrację tangencjalną (TFF) i chromatografię w celu skutecznego usuwania zanieczyszczeń. 

Transkrypcja in vitro (IVT): Zlinearyzowany i oczyszczony pDNA jest następnie transkrybowany do mRNA w reakcji enzymatycznej.

• Kluczowe składniki transkrypcji in vitro to polimeraza RNA, która katalizuje transkrypcję DNA do mRNA; trifosforany rybonukleozydów (rNTP), które służą jako budulce mRNA; pirofosfataza nieorganiczna (IPP), która zwiększa wydajność mRNA; oraz inhibitory RNazy, które zapobiegają degradacji RNA. Bufor transkrypcyjny zazwyczaj zawiera ditiotreitol (DTT) w celu redukcji wiązań disiarczkowych i hamowania aktywności RNazy, natomiast spermidyna jest dodawana w celu poprawy wydajności transkrypcji i stabilizacji kwasów nukleinowych. Aby zminimalizować ryzyko degradacji enzymatycznej na tym kluczowym etapie procesu, niezbędne jest wybranie substancji chemicznych, które zostały przetestowane pod kątem braku aktywności endonukleazy. Aby uzyskać kompleksowy przegląd naszych wysokiej jakości substancji chemicznych i substancji pomocniczych, w tym szerokiej gamy produktów wolnych od endonukleazy, zapoznaj się z naszą broszurą „Substancje chemiczne do produkcji leków na bazie mRNA”.
• Monitorowanie transkrypcji: Podczas reakcji IVT należy monitorować krytyczne parametry procesu (CPP) w celu kontroli krytycznych atrybutów jakości (CQA) i zapewnienia optymalnego przetwarzania. Skuteczne monitorowanie umożliwia bardziej kontrolowaną produkcję i szybszą reakcję na zmienność procesu. 

Capping: Po transkrypcji do transkryptu mRNA dodawana jest struktura czapeczki 5', aby poprawić stabilność i transdukcję w komórce gospodarza. Czapeczkę można dodać na dwa sposoby:

• Capping współtranskrypcyjny: wykonywany podczas etapu IVT. Jednak wydajność i uzysk są niskie, a podejście to może generować nieczystości bez czapeczki z powodu nieprawidłowego wiązania lub odwrotnego wbudowania.
• Capping enzymatyczny (lub capping potranslacyjny) jest wykonywany po oczyszczeniu mRNA. W tym podejściu zazwyczaj wykorzystuje się enzym cappingowy do dodania czapeczki do oczyszczonego mRNA. Chociaż podejście to jest bardziej wydajne, jest też droższe i stanowi dodatkowy etap przetwarzania po oczyszczeniu.

Oczyszczanie mRNA

Po transkrypcji in vitro mRNA jest oczyszczane z zanieczyszczeń i materiałów użytych w poprzednich etapach, w tym endotoksyn, immunogennego dwuniciowego RNA (dsRNA), resztek matrycy DNA, polimerazy RNA i zanieczyszczeń elementarnych. Dostępnych jest kilka opcji oczyszczania mRNA i usuwania resztek DNA.

Separacja chromatograficzna, taka jak chromatografia jonowa w fazie odwróconej (IPRP), wymiana anionowa (AEX) i chromatografia powinowactwa (AC) z wykorzystaniem wychwytywania poli(dT) (ryc. 3), skutecznie oczyszcza docelowy mRNA i usuwa matrycę DNA, eliminując potrzebę trawienia DNA^{1, 3}. Chromatografię stosuje się również po enzymatycznym czapeczkowaniu w celu usunięcia niepożądanych transkryptów mRNA i zanieczyszczeń oligonukleotydowych.

Rysunek 3: Porównanie chromatografii par jonowych w fazie odwróconej, chromatografii anionowymiennej i chromatografii powinowactwowej w oczyszczaniu mRNA (DBC: dynamiczna zdolność wiązania).^4,5

• Chromatografia jonowo-parowa w fazie odwróconej (IPRP) może być stosowana na małą skalę do skutecznego wychwytywania docelowego jednoniciowego RNA (ssRNA) i oddzielania go od zanieczyszczeń. Ponieważ jednak metoda ta wymaga użycia rozpuszczalników, jest mniej odpowiednia do produkcji zgodnej z GMP i lepiej sprawdza się w procesie oczyszczania niż w wychwytywaniu.
• Chromatografia anionowymienna (AEX) charakteryzuje się wysoką dynamiczną zdolnością wiązania i skutecznie usuwa zanieczyszczenia, takie jak dsRNA, RNA bez czapeczki, hybrydy RNA–DNA oraz inne struktury RNA, takie jak mRNA typu „hairpin”. Chociaż w metodzie AEX stosuje się roztwory wodne, wymaga ona potencjalnie toksycznych środków chaotropowych oraz temperatur roboczych do 85 °C w celu desorpcji dużych cząsteczek mRNA związanych z żywicą.
• Chromatografia powinowactwa (AC) z wychwytywaniem poli(dT) wykorzystuje żywicę do specyficznego wychwytywania ogona poli(A) pełnej długości transkryptów mRNA. Metoda ta skutecznie usuwa DNA, nukleotydy, enzymy, składniki buforu i wszelkie inne zanieczyszczenia, które nie posiadają ogona poli(A). Z tego powodu AC jest powszechnie stosowana do wstępnego wychwytywania mRNA, a następnie stosuje się AEX do oczyszczania.
• Ostateczne stężenie i diafiltracja są przeprowadzane po etapie (etapach) chromatografii w celu maksymalizacji czystości produktu i przeniesienia mRNA do odpowiedniego buforu w celu przygotowania preparatu lub przechowywania.

Kwestie związane ze skalowaniem

Technologie jednorazowego użytku zapewniają skalowalność, elastyczność i jakość producentom posiadającym szeroki wachlarz celów i stanowią kluczowy czynnik umożliwiający realizację wielu procesów produkcji mRNA zgodnych z GMP. Produkcja zgodna z GMP wykorzystuje zalety etapów TFF lub chromatografii do wydajnej separacji na dużą skalę, zastępując alternatywne metody oczyszczania typowe dla rozwoju procesów na małą skalę. Należy pamiętać o następujących kwestiach:

• Etapy TFF lub chromatografii zastępują etapy ekstrakcji rozpuszczalnikowej i strącania, często stosowane w rozwoju procesów mRNA.
• W miarę możliwości należy stosować wysokiej jakości substancje chemiczne i odczynniki wolne od endonukleaz, aby poprawić stabilność mRNA i zminimalizować możliwość jego degradacji.

W ostatnich latach odnotowano znaczące sukcesy we wdrażaniu szczepionek mRNA wśród dużych populacji pacjentów. Chociaż nadal istnieją wyzwania, skupienie się na maksymalizacji stabilności mRNA poprzez stosowanie wysokiej jakości chemikaliów i odczynników wolnych od endonukleaz, optymalizację i dostosowanie technologii oczyszczania chromatograficznego w celu maksymalizacji separacji i usprawnienia skalowania, zaowocowało znacznym postępem w zakresie szablonów produkcji GMP.  

Aby technologia mRNA mogła w pełni wykorzystać swój potencjał, potrzebne będą innowacyjne rozwiązania, wiedza specjalistyczna i pomysłowość, które pozwolą na stworzenie niezawodnych platform na skalę przemysłową. Dzięki naszym produktom, usługom i wiedzy technicznej angażujemy się w opracowywanie zintegrowanych rozwiązań usprawniających produkcję mRNA.

Bibliografia

1. Bancel S, Issa J, Aunins J. Ribonucleic acid purification (Patent No. WO2014152031A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152031A1/en

2. Kiesewetter A, Gupta A, Heinen‐Kreuzig A, Greenhalgh T, Stein A. 2023. Improved endotoxin removal using ecofriendly detergents for intensified plasmid capture. Biotechnology Progress. 39(6): https://doi.org/10.1002/btpr.3375

3. Bancel S, Issa J, Aunins J, Chakraborty T. 2014. Manufacturing methods for production of rna transcripts (Patent No. WO2014152027A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152027A1/en

4. Issa J, Barberio J, Aunins J, Aefyan N. Ion exchange purification of mRNA (Patent No. WO2014144767A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014144767A1/en

5. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, Shi Y, Sadtler K, Gao W, Lin J, et al. 2019. Delivery of mRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cell activation. Nat Biotechnol. 37(10):1174-1185. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0247-3