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主页食品饮料测试的化学分析刀豆脲酶的酶法测定

刀豆脲酶的酶法测定

1.目标

建立刀豆脲酶的标准酶法测定步骤。

2.适用范围

本操作程序适用于所有酶法测定具有刀豆脲酶活性的产品。本测定法不适用于巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)脲酶(货号U7127)活性的测定。

3.定义

3.1 纯水=来自去离子系统的水,25ºC条件下电阻率~18MΩ•cm

3.2 脲酶单位定义——一微摩尔单位在pH 7.0、25℃下每分钟催化尿素释放1.0 μmole NH3 。它相当于1.0 I.U.或0.054 Sumner单位(在pH 7.0、20°C下,5分钟产生1.0 mg氨氮)

4.讨论

尿素+ H2O 脲酶 > CO2 + 2NH3

5.责任

应由经过培训的分析服务实验室人员负责按照书面规定执行此程序。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件
T=25 °C, pH=7.0

7.2 方法
滴定

7.3试剂:

7.3.1 750 mM 磷酸钾缓冲液,pH 7.0、25 °C(缓冲液
使用Sigma-Aldrich产品如S0751用纯水配制90.0 mg/mL磷酸二氢钠溶液。在25 °C下,用5N NaOH调节PH至7.0。

7.3.2 500 mM尿素,含0.05% (w/v)牛血清白蛋白溶液(尿素)
使用Sigma-Aldrich产品如U1250配制30.0mg/mL尿素溶液,并使用Sigma-Aldrich产品如试剂7.3.1(缓冲液)中的A4503配制0.50 mg/mL牛血清白蛋白溶液。在25 °C下,用1N HCl或1N NaOH调节PH至7.0。

7.3.3 0.40% (w/v) 对硝基苯酚溶液(指示剂
使用Sigma-Aldrich产品如1048用纯水配制4.0 mg/mL对硝基苯酚溶液。完全溶解可能需要超声或振荡处理。

7.3.4 100 mM标准盐酸溶液(HCl)
用1N盐酸,如Sigma-Aldrich产品编号318949使用纯水配制1:10稀释液。根据Sigma-Aldrich操作步骤PROC-DEK-OP-002884进行标准化。

7.3.5 20 mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0、25 °C(酶稀释剂
使用Sigma-Aldrich产品如S0751,用纯水配制2.4 mg/mL磷酸二氢钠溶液。在25 °C下,用1N NaOH调节PH至7.0。

7.3.6 脲酶(
临用前,用冷的试剂7.3.5(酶稀释剂)配制含200-400 单位/mL脲酶的溶液。

7.3.6.1 对于粗制脲酶产品,可能必需在冰上强力搅拌以获得均一悬液。如强力搅拌仍无法取得均一样品,可将样品以1000rpm离心1分钟。待较大的不溶性颗粒完全清除后继续检测上清液。

7.4 测定方法

7.4.1 将下列试剂(mL)加入适宜的容器中:

7.4.2 使用适当的恒温水浴平衡至25 °C。至少错开两分钟添加每份等分样品:

7.4.3 涡旋混匀并在25 °C下孵育整整5分钟。然后添加:

7.4.4 使用适宜的磁力搅拌器,立即用少量试剂7.3.4(HCl)滴定,直到指示剂颜色从黄色变为无色。这是滴定终点。记录试样和空白溶液的试剂7.3.4(HCl)用量。

7.5 计算

7.5.1 ΔVHCl = V试样 - V空白

7.5.2单位/mL 酶
=
(HCl 摩尔浓度)(ΔVHCl)(1000)(df)
(5)(0.01)

式中:

ΔVHCl = 滴定所用试剂7.3.4(HCl)总体积 (毫升)
1000 = 依照单位定义,从微摩尔到毫摩尔的换算系数
df = 稀释因子,如可用
5 = 依照单位定义的检测时间(分钟)
0.10 = 所用酶体积(毫升)

7.5.3单位/mg 固体 =单位/mL 酶
mg 固体/mL 酶


7.5.4 单位/g 固体 = 单位/mg 固体 x 1000

7.6 最终检测浓度
在1.10 mL反应混合液中,最终浓度为684 mM磷酸钠、455 mM尿素、0.05% (w/v)牛白蛋白和20-40单位尿素。

8.审批

本文档将采用EDMS生成的电子审核、批准和签名。如果需要带有签名验证的硬拷贝,请打印“供使用”副本。

材料
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