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酶促法测定半乳糖(半乳糖检测)

该检测方法适用于使用半乳糖检测试剂盒(MAK012),对细胞和组织培养的上清液、尿液、血浆、血清和其他生物样品中的半乳糖和乳糖进行比色/荧光检测。在该检测试剂盒中,半乳糖被半乳糖氧化酶氧化,产生比色(570 nm)/荧光(λex = 535 nm/λem = 587 nm) 产物,且产物量与所含的半乳糖成比例。对于荧光检测,该试剂盒具有0.2-1.0 nmol半乳糖的线性检测范围,对于比色检测,则为2-10nmol半乳糖检测范围。

注意事项和免责声明

本产品仅可用于研发用途,不可用于药物、家用或其他用途。请参阅产品化学品安全技术说明书,获取危害和安全操作方法相关信息。

试剂

半乳糖检测缓冲液 25 mL
货号MAK012A

半乳糖探针,溶于DMSO 0.2 mL
货号MAK012B

半乳糖酶混合物 1 vl
货号 MAK012C

辣根过氧化物酶(HRP) 1 vl
货号MAK012D

半乳糖标准品,100 nmole/μL 0.1 mL
货号MAK012E

需自备的试剂和设备

96孔平底板 - 建议使用带有透明底部的黑色平板(货号M5686或同类产品)进行荧光测定,使用透明板(货号M4436或同类产品)进行比色测定。

荧光或分光光度计多孔板读数器

制备说明

半乳糖检测缓冲液——使用前放置至室温。

半乳糖探针—— 即用型,按供应原样使用。使用前将半乳糖探针放置至室温。避光-20°C条件下进行保存,并在2个月内使用。

对于荧光检测,在使用半乳糖探针前,用半乳糖检测缓冲液将等分试样的半乳糖探针溶液稀释5至10倍。这将减少荧光检测的背景信号。

半乳糖酶混合物和辣根过氧化物酶——分别将二者溶于220 μL半乳糖检测缓冲液中。用移液枪充分混合后,分别分装在-20°C避光条件下保存。在溶解后
2个月内使用完,并在使用时保持冷藏。

储存方法/稳定性

本试剂盒在湿冰上运输。建议–20°C避光储存。

所有样品和标准品应一式两份运行。

用于比色检测的半乳糖标准品
用990μL半乳糖检测缓冲液稀释10μL的100 mM(100 nmole /μL)半乳糖标准溶液制备1 mM(1 nmole/μL)的标准溶液。充分混合后,加入0、2、4、6、8和10μL的1 mM半乳糖标准溶液至96孔板中,配制成0(检测空白)、2、4、6、8和10 nmole /孔的标准溶液。向每个孔中加入半乳糖检测缓冲液,使终体积达到50 μL。

用于荧光检测的半乳糖标准品
对于比色测定,准备1 mM半乳糖标准溶液。用180μL半乳糖检测缓冲液稀释20μL的1 mM标准溶液,以制备0.1 mM (0.1 nmole/μL)标准溶液。将0、2、4、6、8和10μL的0.1 mM半乳糖标准溶液加入至96孔板中,配制成0(检测空白)、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 nmole /孔的标准溶液。向每个孔中加入半乳糖检测缓冲液,使终体积达到50 μL。

样品制备液体样品可以直接进行测定。加入半乳糖检测缓冲液将使样品终体积达到50μL。

对于未知样品,建议测试几份样品稀释液,确保读数在标准曲线的线性范围内。

检测反应
1. 根据表1中的方案配制反应预混液。每个反应(孔)需要50μL反应预混液。

表1.反应混合物

2. 向每个孔中加入50μL反应预混液。使用水平振荡器或通过移液枪充分混合,并在37℃下孵育反应60分钟。在孵育期间需保证避光。

3. 对于比色测定,测定570 nm处的吸光度(A570)。对于荧光测定,测定荧光强度(λex = 535/λem = 590 nm)。

结果

计算
设置半乳糖标准品中空白组所对应的值为背景值。通过从所有读数中减去空白组吸光值来校正背景。背景值可能很高,必须从所有读数中减去。使用相应的半乳糖标准品的吸光值绘制标准曲线。
注意:每次运行测定方案时,都必须绘制新标准曲线。

半乳糖浓度

Sa/Sv = C

Sa = 来自标准曲线的
未知样品中的半乳糖量(nmole)
Sv = 加入板孔中的样品体积
C = 样品中半乳糖的浓度

样品计算
半乳糖量(Sa) = 5.84 nmole
(来自标准曲线)
样品体积(Sv) = 50 μL

半乳糖分子量 = 180.16

样品中半乳糖的浓度

5.84 nmole/50 μL = 0.1168 nmole/μL

0.1168 nmole/μL x 180.16 ng/nmole = 21.04 ng/μL

MAK012-标准曲线
材料
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