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[主页](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh)[基因表达与沉默](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/applications/genomics/gene-expression-and-silencing)Spinoculation实验方案
# Spinoculation实验方案
MISSION® TRC shRNA文库基于慢病毒的shRNA载体集，用于基因敲低研究。本实验方案描述了MISSION® TRC shRNA慢病毒颗粒的用途，特别是对悬浮细胞进行长期沉默和表型观察。以下方案提取自文献1用于含有MISSION®慢病毒颗粒的6孔板。
还对ExpressMag™系统 ([SHM01](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/SHM01)或 [SHM02](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/SHM02)) 进行了优化，以在比该实验方案更少的24小时内在多种组织培养形式中转导悬浮细胞。
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## [](https://www.sigmaaldrich.com)材料
#### MISSION®慢病毒颗粒
利用 [SHC002V](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/sch002v) 或 [SHC001V](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/SHC001V) 优化转导实验方案。[SHC003V](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/SHC003V)的转导可以通过FACS或荧光显微镜进行监测，但是该实验方案不在本文的范围之内。首先要优化您的实验方案，保证您对转导效率充满信心。这将从转导效率中解构出慢病毒有效载荷（shRNA或定制有效载荷）的影响。然后，当切换到表达shRNA的MISSION®慢病毒时，所得到的菌落或活细胞数量的任何变化都可以归因于shRNA的作用，并且不能归因于低转导效率。转导效率得到优化后，利用表达目标基因shRNA的MISSION® 慢病毒颗粒或表达任何shRNA或目标基因的定制MISSION®慢病毒颗粒。
__嘌呤霉素 (P9620)__ ([P9620](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/P9620))
供选择的10 mg/mL储液
__完全培养基__
对于Jurkat细胞，包含10%热灭活的胎牛血清的DME或适合您的细胞类型的培养基。
__台盼蓝__ ([93595](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sial/93595))
__12 x 15 mL 锥形管__ ([CLS430790](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/CLS430790))
__6孔组织培养板__ ([CLS3516](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/CLS3516))
__摇摆斗式离心机__
离心机应配备温度控制器，并且在细胞转导之前预热至32℃。
__血细胞计数器__([Z359629](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/Z359629))
血细胞计数器用于细胞计数。
## [](https://www.sigmaaldrich.com)实验方案
01. 确定筛选要使用的最终嘌呤霉素浓度。确切的浓度是细胞系依赖性的，应通过对未转导的细胞进行72小时的细胞毒性测试来确定。
02. 只使用无菌物品，并在整个过程中使用标准的组织培养无菌技术。
03. 将所有培养基预热至37℃。
04. 对培养的活Jurkat细胞进行计数。
05. 将Jurkat细胞稀释到完全培养基中，终浓度为1x105个细胞/mL，终体积为14 mL。
06. 将2 mL 1x105个细胞/mL转移到6个15 mL无菌锥形管中。
07. 将MISSION®慢病毒颗粒溶液加到Jurkat细胞中，使得每个锥形管的最终感染复数(MOI)等于0、0.1、0.5、1.0、5.0或10。0 MOI表示您的未转导的阴性对照。
08. 在32℃下以800 x *g*将细胞离心30分钟。
09. 根据惯例，吸出含病毒培养基并进行适当处理。
10. 通过上下轻轻吹打团块将每份细胞团块重悬于2 mL培养基中，并将每份重悬的团块转移至6孔组织培养板中的各自孔中。
11. 将板放回组织培养箱，培养三天。
12. 3天后，将细胞转移到6个单独的15 ml锥形管中，并以200 x *g*离心5分钟。弃去培养基，并用2 ml含嘌呤霉素的完全培养基替换。
13. 将组织培养板放回培养箱过夜。
14. 将细胞维持在嘌呤霉素中，直到通过检查或台盼蓝染色确定未转导的阴性对照细胞死亡。
#### 注意[](https://www.sigmaaldrich.com)
用下面的公式计算孔的MOI。病毒滴度将在分析证明书中提供。病毒体积是加到含有待转导细胞的孔/离心管中的体积，以mL为单位。细胞数等于孔/离心管中活细胞的总数。
| | | |
|-----|---|--------------------------|
| MOI | = | 病毒滴度 (TU/mL) x 病毒体积 (mL) |
| | | 细胞数 |
1\.
O'Doherty U, Swiggard WJ, Malim MH. 2000. Human Immunodeficiency Virus Type 1 Spinoculation Enhances Infection through Virus Binding. J. Virol.. 74(21):10074-10080. [https://doi.org/10.1128/jvi.74.21.10074-10080.2000](https://doi.org/10.1128/jvi.74.21.10074-10080.2000)
__相关实验方案__
- [X-tremeGENE™ 9 DNA转染试剂实验方案](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/xtg9-general-protocol)
- [X-tremeGENE™ HP DNA转染试剂实验方案](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/xtghp-general-protocol)
- [CRISPR / Cas核酸酶RNA介导的基因组编辑](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/technical-documents/protocol/genomics/advanced-gene-editing/crispr-cas9-genome-editing)
- [植物CRISPR/Cas9基因组编辑](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/technical-documents/protocol/genomics/advanced-gene-editing/genome-editing-in-plants-with-crispr-cas9)
- [慢病毒转导实验方案](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/technical-documents/protocol/genomics/advanced-gene-editing/lentiviral-transduction)
- [Escort™ IV Transfection Reagent Protocol](https://www.sigmaaldrich.com/SG/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/escort-4-transfection-reagent)
- [Preparation of Cationic Liposomes & Transfection of Cells - Avanti Research™ Polar Lipids](https://www.sigmaaldrich.com/SG/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/preparation-of-cationic-liposomes-transfection-of-cells0)
- [Protocol for Transducing Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) using MISSION® ExpressMag™ Super Magnetic Kit®](https://www.sigmaaldrich.com/SG/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/transducing-mouse-embryonic-fibroblasts)
- [查看更多](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search)
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