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主页PCR的应用寡核苷酸退火实验方案

寡核苷酸退火实验方案

本实验方案用于两条序列互补的单链寡核苷酸的退火反应(图1)。加热后冷却有助于杂交反应的进行。

退火反应示例图

图 1.退火反应示例图。加热“打破”了所有的氢键,从而破坏了每个寡核苷酸内的全部二级结构。随后,缓慢的冷却促进了杂交反应,最终在互补的序列间形成新的氢键。

寡核苷酸退火实验方案的定义/缩写

EDTA:乙二胺四乙酸

NaCl:氯化钠

Trizma® 碱:Tris(三羟甲基氨基甲烷)的商名

Oligo:寡核苷酸或寡聚物的缩写。寡核苷酸是短单链DNA或RNA分子,必须对其进行退火(加热或解链),才可与适当的互补DNA或RNA链结合并形成双链。

DNA退火:本页讨论了所有寡核苷酸的退火过程。有时将退火也泛称为DNA退火——即使该过程也适用于RNA。退火是加热和冷却两条具有互补序列的单链寡核苷酸的过程。热量会破坏所有氢键,而冷却则会在序列之间形成新的键。

DNA / RNA退火设备和耗材

  • 恒温槽或热循环仪
  • 2 mL 离心管
  • 移液器吸头
  • Milli-Q® H2O
  • EDTA(货号E9884)
  • NaCl(货号S3014)
  • Trizma®碱(货号93362)
  • 两条序列互补的单链寡核苷酸

DNA / RNA退火方法

该退火反应分为两个主要的步骤:1)溶解,2)使用恒温槽或者热循环仪退火。

Oligo 溶解

尽管每种寡核苷酸都是已知量的,我们仍然建议使用分光光度计进行验证, 这可以保证加入反应的每种寡核苷酸是等量的。

  • 将每种寡核苷酸溶解在一定体积的退火缓冲液(请参阅补充说明)中使得浓度相同。
  • 每种寡核苷酸溶液的浓度都需要是双链寡核苷酸目标浓度的2倍。

示例

双链寡核苷酸目标浓度为50 µM。

  1. 寡核苷酸1:标注OD值为10.55(312.6 µg, 49.9 nmol),使用分光光度计验证OD值。
  2. 寡核苷酸2:标注OD值为9.04(279.7 µg, 45.9 nmol),使用分光光度计验证OD值。
  3. 由于每种寡核苷酸原液的浓度都需要是双链寡核苷酸目标浓度的2倍,因此,每种原液的浓度需要达到100 µM。
    1. 对于寡核苷酸1,需添加 49.9 x 10 = 499 µL的退火缓冲液以得到100 µM的原液。
    2. 对于寡核苷酸2,需添加 45.9 x 10 = 459 µL的退火缓冲液以得到100 µM的原液。

*以上为配制100 µM溶液的简单计算方法,仅作为示例。

Oligo退火

恒温槽

  1. 在离心管内混合等体积的等摩尔浓度的寡核苷酸。
  2. 将离心管于95 °C培养5 min。
  3. 将离心管置于室温缓慢冷却(应<60 min)

热循环仪

相对于恒温槽,热循环仪的稳定性更好。

  1. 在PCR管内混合等体积的等摩尔浓度的寡核苷酸。
  2. 使用下面的温度设定程序:
    1. 加热至95 °C并保持2 min。
    2. 在45 min内冷却至25 °C 。
    3. 冷却至4 °C 以短期保存。
  3. 对PCR管短时离心并弃去上层水分。

在恒温槽或者热循环仪操作后,得到的双链寡核苷酸可以用于后续操作或者用于保存。更多关于保存核苷酸的信息,请参阅“处理指南和稳定性”。

DNA退火缓冲液配方

所有缓冲液均采用Milli-Q®纯水配制。

退火缓冲液组分 (1X)

  • 10 mM Tris, pH 7.5 - 8.0
  • 50 mM NaCl
  • 1 mM EDTA

连接酶缓冲液组分 (1X)

此缓冲液通常用于T4 DNA连接酶。

  • 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • 10 mM MgCl2
  • 1 mM ATP
  • 10 mM DTT

激酶缓冲液组分 (1X)

此缓冲液通常用于T4多核苷酸激酶。

  • 70 mM Tris-HCl, pH 7.6
  • 10 mM MgCl2
  • 5 mM DTT