使用SYBR Green染料检测的逆转录实验方案

 

逆转录

逆转录(RT)是指使用逆转录酶和dNTP将RNA转化为cDNA的过程。该过程既可对总RNA进行RT步骤，从而产生代表样品中所有RNA转录本的整体cDNA（通常通过两步法），也可通过基因特异性方法，仅将目标RNA转化为cDNA（通常遵循一步法）。

下述实验可用作RT基础实验方案，供研究人员对其进行修改以满足特定要求。通常使用两步法制备cDNA，随后在加入PCR / qPCR体系之前对cDNA进行稀释，或者通过一步法反应进行制备，依次进行两个过程。

设备

• 定量PCR仪器
• 用于RT-qPCR设置的层流罩（可选）

试剂

• RNA（约1μg/μL储存液）
• SYBR Green 定量RT-PCR试剂盒（货号QR0100）
• PCR级水：PCR级水（货号W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
• 正向和反向PCR引物（10μM工作原液）：
  • 可在这里订购定制的寡核苷酸。 
    

仪器	参比染料 的终浓度	参比染料的μL数 （每20 μL反应）
Applied Biosystems 5700	1X	0.2
Applied Biosystems 7000	1X	0.2
Applied Biosystems 7300	1X	0.2
Applied Biosystems 7500	0.1X	0.02
Applied Biosystems 7500 Fast	0.1X	0.02
Applied Biosystems 7700	1X	0.2
Applied Biosystems 7900	1X	0.2
Applied Biosystems 7900 HT Fast	1X	0.2
Applied Biosystems 7900HT	1X	0.2
Applied Biosystems StepOnePlus™	1X	0.2
Applied Biosystems StepOne™	1X	0.2
Applied Biosystems ViiA 7	0.1X	0.2
Bio-Rad CFX384™	未使用	-
Bio-Rad CFX96™	未使用	-
Bio-Rad MiniOpticon™	未使用	-
Bio-Rad/MJ Chromo4™	未使用	-
Bio-Rad/MJ Opticon 2	未使用	-
Bio-Rad/MJ Opticon™	未使用	-
Cepheid SmartCycler®	未使用	-
Eppendorf Mastercycler® ep realplex	未使用	-
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s	未使用	-
Illumina Eco qPCR	未使用	-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000	未使用	-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000	未使用	-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q	未使用	-
Roche LightCycler® 480	未使用	-
Stratagene Mx3000P®	0.1X	0.02
Stratagene Mx3005P™	0.1X	0.02
Stratagene Mx4000™	0.1X	0.02

耗材

• 无菌过滤器移液管吸头
• 无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管（货号CLS430909）
  
  • PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：
  • 单个薄壁200 μL PCR管（货号Z374873或P3114）
  • 孔板
      - 96孔板（货号Z374903）
      - 384孔板（货号Z374911）
    
  • 封板膜
      - ThermalSeal RTS™封膜（货号Z734438）
      - ThermalSeal RT2RR™膜（货号Z722553）

方法

在下面给出的实验案例中，研究人员可以根据优化实验的结果对引物浓度进行调节（参见引物浓度优化、温度梯度法引物优化和检测方法优化和验证章节）。

1. 将试剂盒组分和RNA样品置于冰上。
2. 混合然后短暂离心以收集管底部的内容物。
3. 为每个反应和对照准备一份预混液，并根据表P11-28，额外添加10％的RT酶以允许移液误差
   。
4. 为每个对照组准备一个预混液，并根据
   表P11-28，额外添加10％的PCR级水（而非RT酶）代替酶以允许移液误差。

表P11-28.用于一步法SYBR Green I RT-PCR反应的预混液。

试剂	每次单次25 μL反应 的体积 (μL)
2× SYBR Green定量RT-PCR缓冲液（QR0100）	12.5
仪器特定专用参比染料（可选），见表 P4-7	0.025
正向引物(10 μM)	1.125
反向引物(10 μM)	1.125
PCR级纯水	9.1
MMLV RT酶	0.125

5. 向每个PCR管中加入1μL总RNA（每次反应250-2500ng）。如果使用PCR板，请按照板示意图进行操作，以确保将反应混合物、样品和对照物加入到正确的孔中。
   
6. 向每个孔中加入24μL 预混液，将无RT混合物添加至负RT对照样品中。
   
7. 密封每个反应或孔板后，轻轻涡旋以混合内容物。
   
8. 短暂离心以收集反应管底部的组分。
   
9. 根据表P11-29设置实时qPCR。

表P11-29.用于一步法SYBR Green I RT-qPCR的RT PCR循环参数。

循环条件	温度 (°C)	时间
第一链合成	42–44	30 min
变性/ RT失活	94	30 s
步骤1-3重复40个循环
第1步	95	5 s
第2步	55	15 s
第3步	72	10 s

10. 进行反应后熔融分析。

材料

抱歉，发生了意外错误

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