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标准 PCR 程序

如何进行 PCR

标准的聚合酶链反应（PCR）设置包括四个步骤：

  1. 在 PCR 管中加入所需的试剂或混合母液和模板。
    *在没有加热盖的热循环仪中加入矿物油以防止蒸发。
  2. 根据热循环仪和引物参数进行扩增。
  3. 通过琼脂糖凝胶电泳评估扩增的 DNA，然后进行溴化乙锭染色。
将 PCR 管装入热循环仪，进行 PCR 扩增步骤。

下面将详细介绍这些步骤以及材料和试剂选择技巧。这是一个使用 Taq DNA 聚合酶的基本 PCR 方案。

PCR 步骤和基本 PCR 组件

PCR 反应的故障排除涉及许多因素。观看本动画，了解根据您的需要选择正确的组件和循环条件如何有助于获得最佳结果。

在我们的《PCR 技术指南》的Protocols部分查找其他聚合酶或高级 PCR 技术的其他协议。

在我们的 Reagents：PCR 需要什么？

PCR 中使用的试剂推荐产品  <
Taq DNA 聚合酶根据用户偏好选择 Taq DNA 聚合酶。(请参阅下面单独的 Taq 聚合酶表 。
PCR级水PCR试剂水
稀释至工作浓度的前体
10 µM工作储备液足以进行大多数检测。
寡核苷酸定制寡核苷酸
待扩增的 DNA由研究人员提供
专用移液管 
恒温器
热循环仪具有各种孔块尺寸或多种格式
热循环仪具有各种孔块尺寸或多种格式
无菌过滤吸头 
无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管康宁® 螺旋盖微量离心管
Signified 1.
PCR 管或板选择适合 cycler 的：
     Individual thin-walled 200 µL PCR tubes
    200 µL strip tubes
    多孔板 和 板封
dNTP 混合液脱氧核苷酸混合液 ；含 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 10 mM

*混合物已包含 dNTPs

什么是 Taq Polymerase?

Taq DNA 聚合酶是一种来自嗜热细菌 水生hermus的恒温酶。 它 常用于在 PCR 中扩增 DNA 片段。这种酶是重组形式，在大肠杆菌中表达。它能经受反复加热至 95 °C（PCR 技术要求）而不会明显丧失活性。通过 SDS-PAGE 分析，该酶的分子量约为 94 kDa，没有检测到内切酶或外切酶活性。它具有 5'→3' DNA 聚合酶活性和 5'→3' 外切酶活性。每个批次的 Taq DNA 聚合酶都经过 PCR 扩增和双链测序测试。该酶的供应量为 5  单位/µL，并配有优化的 10 倍反应缓冲液。

标准 Taq DNA 聚合酶。DNA聚合酶

使用下表为您的反应条件选择合适的 Taq DNA聚合酶混合物。可选择含或不含氯化镁（MgCl2）的透明或红色染色配方，或预先准备好的预混液或含缓冲液和 dNTPs 的混合母液。

Containing MgCl2              分离氯化镁2预混料nbsp;                    ；
不含染料的透明配方含红色染料，可直接加载到凝胶上不含染料的透明配方含红色染料，可直接加载到凝胶上不含染料的透明配方
Taq DNA Polymerase from Thermus aquaticus (D1806)REDTaq® DNA聚合酶
(D4309)		来自 Thermus aquaticus 的 Taq DNA 聚合酶，不含 MgCl2 (D4545)REDTaq® ReadyMix™ ；PCR反应混合物
(R2523)		ReadyMix™ Taq PCR反应混合物
(P4600)

单位定义：一个单位在 74 °C、30 分钟内将 10 nmol 总脱氧核苷三磷酸酯结合到可酸析的 DNA 中。

程序：PCR 的步骤

Taq DNA 聚合酶、模板 DNA、引物和 MgCl2 浓度的最佳条件取决于所使用的系统。可能有必要确定每种成分的最佳条件。这尤其适用于 Taq DNA 聚合酶、循环参数和 MgCl2 浓度。建议对酶和 MgCl2 进行滴定，以确定最佳效率。

  1. 按表中提供的顺序将试剂加入适当大小的试管中。(对于大量反应，应配制不含模板的母液，并将其等分到反应管中。

标准 PCR 反应

。
AmountComponentFinal Concentration
w µL最终浓度最终浓度
w µLWater 
5 µL10x PCR 缓冲液（P2192 ；或 P2317）*1x
1微升去氧核苷酸混合物200 µM
W µL前向引物
（通常长度为 15-30 个碱基）		0.1-0.5 µM
x µL
 反向引物
（通常长度为 15-30 个碱基）
0.1-0.5 µM
0.5 µL
Taq DNA 聚合酶*
0.05 单位/微升
y µL
Taq&bsp; DNA 聚合酶*
0.valign="top">Template DNA (typically 10 ng)
200 pg/µL
z µL
25 mM MgCl2P2317）
0.1-0.5 mM
50 µL
P2317
0.width="438" valign="top">总反应体积

*同时购买缓冲液和Taq聚合酶： D1806, D4309 或 D4545

Readymix PCR 反应

。
AmountComponentFinal Concentration
25微升
读数valign="top">Readymix (R2523 or ；P4600)
 

前向引物
（通常长度为 15-30 个碱基）
0.1-0.5 µM
x µL
 反向引物
（通常长度为 15-30 个碱基）
0.1-0.5 µM
y µML
模板 DNA（通常为 10 ng） 200 pg/µL
z µL
水
&Dvalign="top"> 
50 µL
总反应体积

注意：如果使用无加热盖的热循环仪，在每支试管顶部加入 50 µL 矿物油以防蒸发。

3.扩增。扩增参数因引物和使用的热循环仪而异。

典型循环参数

建议扩增 25-30 个循环。

PCR 步骤温度 °C持续时间
变温模板
94 °C
1 min
退火引物
 2 min
延长
72°C 3分钟
agarose gel electrophoresis and subsequent ethidium bromide staining.

      Note: Mineral oil overlay may be removed by a single chloroform extraction (1:1), recovering the aqueous phase.

核酸电泳试剂

  • 琼脂糖 （预制凝胶、粉末等）
  • 琼脂糖 （预制凝胶、粉末等）
  • 电泳染色剂或染料 如溴化乙锭
1.
Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695
2.
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3.
Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.
4.
Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.
5.
Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436
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Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775
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10.
Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
11.
Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465
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Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

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。

材料

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