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[主页](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh)[qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/applications/genomics/qpcr)引物浓度优化实验方案
# 引物浓度优化实验方案
## qPCR条件优化
QPCR 条件的优化对于制定稳健的检测方案非常重要。优化不佳的表现是重复样本之间缺乏再现性，以及检测低效且不灵敏。两种主要优化方法是优化引物浓度和/或退火温度。
优化引物浓度的一种方法是建立一个反应阵列。该阵列用来对照伴侣引物的不同浓度来测试每种引物的一系列浓度。本实验方案给出的示例是用一个6×6阵列测试六种浓度（例如50 nM至800 nM）。本实验方案所述的数量都允许每个条件一式两份运行。
## 引物浓度优化实验方案中使用的设备
- 定量PCR仪器
- PCR设置的层流罩（选购件）
## 试剂
- 合适的测定模板，例如1:10稀释的cDNA、gDNA或合成的寡核苷酸模板。
- KiCqStart® SYBR® Green ReadyMix™（KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03—取决于仪器，有关仪器兼容性，请参见__表 P4-6__）。
- PCR级水：PCR级水（W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
- 正向和反向引物浓缩原液（10 μM工作原液）。
• 可以在sigmaaldrich.com/oligos上订购定制寡核苷酸。
热启动预混液 (Taq，Buffer，dNTPs，参考燃料，MgCl2)
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™
（货号 KCQS00)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox
(货号KCQS01)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 带ROX
（货号KCQS02)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 用于 iQ
（货号 KCQS03)
__兼容仪器：____兼容仪器：____兼容仪器：____兼容仪器：__
Bio-Rad CFX384™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 5700Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 7000Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™Fast Applied Biosystems ViiA 7Applied Biosystems 7300Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™Stratagene Mx3000P®Applied Biosystems 7700
Bio-Rad/MJ Chromo4™Stratagene Mx3005P™Applied Biosystems 7900
Bio-Rad/MJ Opticon 2Stratagene Mx4000™Applied Biosystems 7900 HT Fast
Bio-Rad/MJ Opticon® Applied Biosystems 7900HT
Cepheid SmartCycler® Applied Biosystems StepOnePlus™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex Applied Biosystems StepOne™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s
Illumina Eco qPCR
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q
Roche LightCycler® 480
表 P13-31.SYBR Green PCR 混合选择指南
## 耗材
- 无菌过滤器[移液管吸头](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips)
- 无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909)
- PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：
• 单个独立的薄壁200μLPCR管（Z374873或P3114）
• 孔板
- 96孔板（Z374903）
- 384孔板（Z374911）
• 孔板密封
- ThermalSeal RTS™ 封膜 (Z734438)
- ThermalSeal RT2RR™ 封膜 (Z722553)
### 本方案注意事项
- 使用随机引物或oligo-dT引发方法产生cDNA，并以1:10稀释备用，但也可以使用任何合适的替代模板。
- 根据板的布局，所有样品一式两份运行（__图P13-18__）。
__图 P13-18.__引物优化板布局示意图。
## 方法
*__注意：__*将2.0 μL的每种引物加入到总体积为20 μL的反应物中。为此，需要10倍所需浓度原液才能达到所需的最终浓度。
1. 使用10 μM引物原液，将两种引物原液稀释至0.5、1、2、4、6和8 μM，
如__表P13-32__所示。
终
浓度 (μM)
H2O的体积(μL)10 μM原液
的体积 (μL)总
体积 (μL)
0.547.52.550
145550
2401050
4302050
6203050
82080100
表 P13-32.引物浓度优化的引物稀释方案。
2. 按照__表 P13-33__制备qPCR预混液。
（*__注意：__*步骤5中的模板和cDNA应分开加入）。充分混合。
试剂每次
单次20 μL反应的体积 (μL)整个板
的体积 (μL)
（84 + 10％移液误差）
2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR
ReadyMix™10924
PCR级纯水3277.2
参比染料（非必需）192.4
模板，例如cDNA
（原液1:5至1:10稀释）2*
正向引物2*
反向引物2*
表 P13-33.引物浓度优化反应预混液。
*__\*注意：__*在步骤5之前__不要__添加cDNA和引物。
3. 将步骤2中的184.8 μL预混合物（对12× NTC）移入单独的管中，用来设置
无模板对照（NTC）反应。
4. 将26.4 μL的dH2O添加到步骤3中的NTC混合物中（以替换模板）。
*注意：*将NTC混合物置于冰上以备后用。
5. 将158.4 μL cDNA模板添加到步骤2中剩余的预混液中。将预混液置于冰上。
6. 根据__图 P13-18__，将2.0 μL适当的反向引物稀释液添加至PCR板中，再将
800 nM浓度溶液添加到NTC行。
7. 根据__图 P13-18__，将2.0 μL适当的正向引物稀释液添加至PCR板中。
8. 将步骤5中的16 μL预混液等分到PCR板上对应测试反应位置的孔中。
9. 将步骤4中的16 μL 预混液等分到PCR板NTC反应孔中。
10. 封板并贴好标签。（确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。）
11. 根据__表 P13-34__的两步实验方案运行样品。重复执行第1-2步40次，然后进行解离曲线分析。
| | | |
|-------------------|---------|-------|
| 循环条件 | 温度 (°C) | 时间（秒） |
| 初始变性 / 热启动 | 95 | 30 |
| __重复执行第1-2步40次。__ | | |
| 第1步 | 95 | 5 |
| 第2步 | 60 | 30 |
表 P13-34.引物浓度优化的PCR循环条件。
*__说明：__*使用标准解离曲线实验方案（数据收集）。
## 材料
抱歉，发生了意外错误
Response not successful: Received status code 500
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